Aufklärung molekularer Pathomechanismen alpha-Tubulin-mutationsbasierter neuronaler Erkrankungen.

• Antragsteller: Dr. André Voelzmann
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Entwicklungsneurobiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 269898187

Nervenzellen stellen durch ihre kabelähnlichen, Axon genannten, Fortsätze die elektrische Vernetzung des Nervensystems her. Nerven müssen lebenslang gewartet werden, daher haben axonale Schäden durch Verletzungen und ihr Verlust durch Neurodegenerative Erkrankungen verheerende Folgen für Nervenfunktionen.Das Actin- und Mikrotubulus (MT)-Zytoskelett formt das strukturelle Rückgrat von Axonen. Vor allem MTs bilden die Grundlage für lebensnotwendige zelluläre Transporte. Bekannte Mutationen in humanen alpha-Tubulinen führen zu Lissenzephalie, bei der das Auswachsen von Axonen, neuronale Migration und Guidance fehlreguliert sind. Allerdings sind die molekularen Pathomechanismen dieser Mutationen kaum verstanden.Das Projekt zielt auf die Aufklärung dieser Pathomechanismen ab und soll die Fehlregulation von Protein-Netzwerken unterhalb der alpha1-Tubulin-Mutationen mit Hilfe neuronaler Drosophila Zellkulturen und in vivo Analysen aufklären. alpha1-Tubulin ist hochgradig konserviert (in Menschen und Fliegen ist zu 97% identisch), daher ist es wahrscheinlich, dass die identifizierten Protein-Interaktions-Netzwerke in höchstem Maße von der Fliege auf den Menschen übertragbar sind.Spezifische Lissenzephalie-assoziierte Aminosäure-Mutationen werden in Fliegen generiert, um ihren Einfluss auf molekularem, zellulärem und organismischem Level zu studieren. Hierfür wird ein genetischer Null-Hintergrund des neuronalen alpha1-tubulins in Fliegen erzeugt. Mittels CRISPR-Cas9-Homology-vermittelter Reparatur wird hierbei eine PhiC31/attP Platform den endogenen Locus ersetzen, die ein Wiedereinbringen von alpha1-tubulin Varianten mit gezielten Mutationen mittels Recombinase-vermitteltem Kassettenaustausch erlaubt. Auf zellulärer Ebene werden immunohisto- und biochemische Färbungen, realtime qRT-PCR, live cell imaging und genetische Interaktionsstudien durchgeführt um die Funktionalität der Mikrotubuli in alpha1-tubulin-mutierten neuronalen Primär-Kulturen zu analysieren. Hierfür werden Mikrotubulus-Stabilität, -Dynamik, posttranslationale Modifikationen, axonaler Transport und Interaktion mit Mikrotubulus-bindenden Proteinen bestimmt. Auf Organismus-Ebene wird Axon-Guidance, Faszikulierung, neuronales Wachstum und Funktion während Entwicklung und Alterung studiert. Dabei werden das UAS-Gal4 und das klonale MARCM-System für die Expression mutierter alpha1-tubulin Versionen in Kombination mit immunhistochemischen Techniken und Verhaltensassays benutzt.Die vorgeschlagene Strategie wird Änderungen in Protein-Interaktionen mit Mikrotubuli in alpha1-Tubulin-basierten neuronalen Erkrankungen aufklären können. Sie kann für zukünftige Ansätze angepaßt werden um die Bedeutung weiterer posttranslationaler Modifikationen in Tubulinen zu untersuchen, molekulare Aspekte Lissenzephalie-verursachender Mutationen in nicht-neuronalen Geweben aufzuklären und neue molekulare Ziele in tubulinmutationsverknüpften Erkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen zu definieren.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Andreas Prokop