Development and Application of Proton-Detected Solid-State NMR Spectroscopy for Elucidation of Membrane Protein Function

• Applicant: Professor Rasmus Linser, Ph.D.
• Subject Area: Structural Biology ; Biophysics
• Term: from 2015 to 2024
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 270263529

• Final Report Year: 2024

Final Report Abstract

Im Rahmen dieses Projektes sind zahlreiche, teils wichtige methodische Neuerungen für die protonendetektierte Festkörper-NMR-Spektroskopie für Proteine, insbesondere Enzyme, in fester Phase entwickelt worden. Zum einen sind neuen biochemische Ansätzen zur Isotopenmarkierung und innovative Herangehensweisen zur spektroskopischen Datenerhebung und -verarbeitung für die Signalzuordnung von immer komplexeren Zielproteinen entwickelt worden. Des Weiteren sind Methoden entwickelt worden, die robuster und mit höherer Empfindlichkeit atomar aufgelöste Struktur- und Beweglichkeitseigenschaften dieser Proteine abbilden können. Repräsentative Anwendung fanden die Experimente insbesondere für die zwei Enzyme Carboanhydrase und Tryptophansynthase, für die ein tieferes Verständnis ihrer inneren Bewegungen und dem Zusammenspiel dieser mit ihren katalytischen Eigenschaften erlangt wurde. Insbesondere wurde ein Zusammenspiel zwischen Konformationsdynamik und Eigenschaften des in der aktiven Tasche residierenden Wassers (Carboanhydrase) bzw. eine Kopplung zwischen globaler Konformationsdynamik und Protonierungswahrscheinlich einer für den ersten Schritt der Katalyse wichtigen Aminosäureseitenkette gefunden (Tryptophansynthase). Während die Entwicklung neuer Methodik für komplexe Proteine im Festkörper ausgesprochen gut funktionierte und diverse, wachsende Erfolge konstatiert werden konnten, musste der Anwendungsbereich von den ursprünglich avisierten Targets auf präparativ weniger anspruchsvolle Enzyme verlagert werden. Der Grund dafür war der Umzug der Gruppe aus dem ursprünglichen Wirkungsbereich in eine Situation mit weit weniger biochemischem Support, der starke Verzögerungen bzgl. der Präpationen der ursprünglichen Targets (und ein Zuvorkommen einer anderer Gruppe) mit sich brachte und ein Umstrukturieren strategisch notwendig machte. So wurden Carboanhydrase, ein 29 kDa schweres Enzym und im Vergleich mit den bis dato mittels protondetektierter Festkörper-NMR bearbeiteten Proteinen sehr komplexes Protein, sowie – in zweiter Iteration – die Tryptophansynthase, ein mit 72 kDa noch größeres und komplexeres Target, in den Fokus genommen.

Publications

• Backbone assignment for minimal protein amounts of low structural homogeneity in the absence of deuteration. Chemical Communications, 52(21), 4002-4005.
  Xiang, ShengQi; Biernat, Jacek; Mandelkow, Eckhard; Becker, Stefan & Linser, Rasmus
  
• A Two-Component Adhesive: Tau Fibrils Arise from a Combination of a Well-Defined Motif and Conformationally Flexible Interactions. Journal of the American Chemical Society, 139(7), 2639-2646.
  Xiang, Shengqi; Kulminskaya, Natalia; Habenstein, Birgit; Biernat, Jacek; Tepper, Katharina; Paulat, Maria; Griesinger, Christian; Becker, Stefan; Lange, Adam; Mandelkow, Eckhard & Linser, Rasmus
  
• Microsecond Time Scale Proton Rotating-Frame Relaxation under Magic Angle Spinning. The Journal of Physical Chemistry B, 121(25), 6117-6130.
  Rovó, Petra & Linser, Rasmus
  
• Microsecond Timescale Protein Dynamics: a Combined Solid‐State NMR Approach. ChemPhysChem, 19(1), 34-39.
  Rovó, Petra & Linser, Rasmus
  
• Dynamics and Interactions of a 29 kDa Human Enzyme Studied by Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry Letters, 9(6), 1307-1311.
  Vasa, Suresh K.; Singh, Himanshu; Rovó, Petra & Linser, Rasmus
  
• Protons as Versatile Reporters in Solid-State NMR Spectroscopy. Accounts of Chemical Research, 51(6), 1386-1395.
  Vasa, Suresh K.; Rovó, Petra & Linser, Rasmus
  
• Assessment of a Large Enzyme–Drug Complex by Proton‐Detected Solid‐State NMR Spectroscopy without Deuteration. Angewandte Chemie International Edition, 58(17), 5758-5762.
  Vasa, Suresh K.; Singh, Himanshu; Grohe, Kristof & Linser, Rasmus
  
• Fast Microsecond Dynamics of the Protein–Water Network in the Active Site of Human Carbonic Anhydrase II Studied by Solid-State NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society, 141(49), 19276-19288.
  Singh, Himanshu; Vasa, Suresh K.; Jangra, Harish; Rovó, Petra; Päslack, Christopher; Das, Chandan K.; Zipse, Hendrik; Schäfer, Lars V. & Linser, Rasmus
  
• Mechanistic Insights into Microsecond Time-Scale Motion of Solid Proteins Using Complementary 15N and 1H Relaxation Dispersion Techniques. Journal of the American Chemical Society, 141(2), 858-869.
  Rovó, Petra; Smith, Colin A.; Gauto, Diego; de Groot, Bert L.; Schanda, Paul & Linser, Rasmus
  
• The Active Site of a Prototypical “Rigid” Drug Target is Marked by Extensive Conformational Dynamics. Angewandte Chemie, 132(51), 23116-23121.
  Singh, Himanshu; Das, Chandan K.; Vasa, Suresh K.; Grohe, Kristof; Schäfer, Lars V. & Linser, Rasmus
  
• Atomic-resolution chemical characterization of (2x)72-kDa tryptophan synthase via four- and five-dimensional1 H-detected solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences, 119(4).
  Klein, Alexander; Rovó, Petra; Sakhrani, Varun V.; Wang, Yangyang; Holmes, Jacob B.; Liu, Viktoriia; Skowronek, Patricia; Kukuk, Laura; Vasa, Suresh K.; Güntert, Peter; Mueller, Leonard J. & Linser, Rasmus
  
• Unambiguous Side-Chain Assignments for Solid-State NMR Structure Elucidation of Nondeuterated Proteins via a Combined 5D/4D Side-Chain-to-Backbone Experiment. The Journal of Physical Chemistry Letters, 13(7), 1644-1651.
  Klein, Alexander; Vasa, Suresh K.; Söldner, Benedikt; Grohe, Kristof & Linser, Rasmus
  
• 5D solid-state NMR spectroscopy for facilitated resonance assignment. Journal of Biomolecular NMR, 77(5-6), 229-245.
  Klein, Alexander; Vasa, Suresh K. & Linser, Rasmus
  
• Integrated Assessment of the Structure and Dynamics of Solid Proteins. The Journal of Physical Chemistry Letters, 14(7), 1725-1731.
  Söldner, Benedikt; Grohe, Kristof; Neidig, Peter; Auch, Jelena; Blach, Sebastian; Klein, Alexander; Vasa, Suresh K.; Schäfer, Lars V. & Linser, Rasmus
  
• Microsecond Timescale Conformational Dynamics of a Small‐Molecule Ligand within the Active Site of a Protein. Angewandte Chemie International Edition, 63(5).
  Kotschy, Julia; Söldner, Benedikt; Singh, Himanshu; Vasa, Suresh K. & Linser, Rasmus
  
• Protein deuteration via algal amino acids to circumvent proton back-exchange for 1H-detected solid-state NMR. Chemical Communications, 60(22), 3083-3086.
  Aucharova, Hanna; Klein, Alexander; Gomez, Sara Medina; Söldner, Benedikt; Vasa, Suresh K. & Linser, Rasmus