Aufbau und Funktion membranassoziierter Proteingerüste in der Autophagozytose

• Antragsteller: Dr. Thomas Wollert
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 270641522

Bei die Autophagozytose handelt es sich um einen zentralen katabolen Stoffwechselweg, der zytoplasmatische Bestandteile spezifisch oder unspezifisch vom Zytoplasma isoliert und zu lysosomalen Organellen transportiert. Dabei wird eine kappenförmige Membran, der sog. Phagophor, gebildet, welcher sich um das einzuschließende zytoplasmatische Material legt. Der Phagophore expandiert in einem noch schlecht verstandenen Prozess und umschließt dabei sukzessive das abzubauende Material. An dieser Expansion sind eine Vielzahl Autophagozytose-spezifischer (Atg) Proteine, beteiligt. Dabei spielt ein Ubiquitin (Ub)-ähnliches Konjugationssystem eine entscheidende Rolle. Es konjugiert das kleine Ub-ähnliche Protein Atg8 mit der Membran des Phagophors. Die Menge des am Phagophor gebundenen Atg8 korreliert mit der Größe der schlussendlich gebildeten Autophagosomen. Unsere Arbeitsgruppe konnte kürzlich zeigen, dass das lipidierte Atg8 zusammen mit seiner E3-ähnlichen Ligase Atg12-Atg5-Atg16 eine Gerüststruktur mit netzförmiger Architektur an Membranen ausbilden kann. Wir möchten nun verstehen, wie diese Gerüststruktur aufgebaut wird und dabei Membranformen und somit die Expansion des Autophagosoms beeinflusst. In vivo reguliert eine Kaskade von Atg-protein Komplexen die Rekrutierung von Atg12-Atg5-Atg16 zum Phagophor, der mit dem Signallipid Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) angereichert ist. PI3P wird durch eine Autophagozytose- spezifische PI3-kinase gebildet. Nachfolgend wird das PI3P-bindende Protein Atg18 zum Phagophor rekrutiert, welches dem Ub-ähnlichen Konjugationssystem unmittelbar vorgeschaltet ist und vermutlich Atg12-Atg5-Atg16 zum Phagophor rekrutiert. Unser erstes Ziel ist es, die durch Atg18 vermittelte Nukleation und Expansion des Membrangerüstes zu untersuchen. Dafür werden wir den Prozess in vitro mit gereinigten Komponenten rekonstituieren. Die Dynamik des Prozesses werden wir mittels Totaler Interner Refektionsmikroskopie (TIRFM) und Atomarer Kraftmikroskopie (AFM) untersuchen. Zu den an der Autophagozytose beteiligten Proteinen gehört das dem Atg18 homologe Protein Atg21. Im Gegensatz zu Atg18, welches vorwiegend an der stressinduzierten unspezifischen Autophagozytose beteiligt ist, fungiert Atg21 während der spezifischen Autophagozytose, welche dafür verantwortlich ist, geschädigte oder überflüssige zytoplasmatische Bestandteile abzubauen. Unser zweites Ziel beinhaltet die funktionelle Charakterisierung von Atg21. Im besonderen wollen wir untersuchen, ob es dem Atg18 identische oder ähnliche Funktionen ausübt. Obwohl sich die Lokalisation von Atg18 und Atg21 in der Zelle unterscheidet, gibt es Hinweise, dass beide Proteine Heterodimere bilden können. Unser drittes Ziel ist es, die Rekrutierung von Atg18 und Atg21 unter Wachstums- und Stressbedingungen zum Phagophor zu untersuchen. Zusammenfassend soll unsere Studie zeigen, wie der Aufbau des Membrangerüstes unter Wachstums- und Stressbedingungen initiiert und koordiniert wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen