4-color ALEX single molecular FRET setup
Final Report Abstract
Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist ein vielseitiges Werkzeug zur quantitativen Analyse dynamischer Prozesse von Biomolekülen. Sowohl Konformationen bzw. Konformationsänderungen, als auch intermolekulare Wechselwirkungen in und zwischen Biomolekülen können mit dieser Methode nachgewiesen und deren Kinetik bestimmt werden. Insbesondere FRET-Messungen an einzelnen Molekülen (single molecule FRET – smFRET) ermöglichen den Zugang und die Verfolgung dynamischer Prozesse in Echtzeit auf molekularer Ebene. In Kombination mit alternierender Anregung der verwendeten Farbstoffe (alternating light excitation – ALEX) können so kleinste Konformationsänderungen quantifiziert werden. In üblichen smFRET Experimenten werden zwei Farbstoffe verwendet. Damit kann nur bedingt Einblick in die Funktion biologischer Systeme gewonnen werden, da diese im Allgemeinen aus mehr als zwei Komponenten bestehen und sowohl Interaktion als auch Konformationsänderungen gemessen werden müssen. Ein vollständiges Verständnis dieser komplexen biologischen Systemen erfordert sogar eine korrelierte Informationen über Konformationen auf der einen Seite und transienter Wechselwirkungen auf der anderen Seite. Mehrfarbige smFRET-Experimente ermöglichen die direkte Beobachtung solcher korrelierten Dynamiken und Wechselwirkungen. Mit diesem Aufbau ist es uns gelungen, solche korrelierten Dynamiken und Wechselwirkungen am mehrkomponentigen Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) System zu messen. Konformationsänderungen des Hsp90-Proteins und die Nukleotidbindung werden gleichzeitig erfasst und können zueinander in Verbindung gesetzt werden, was mit zweifarbigem smFRET bisher nicht möglich war. Zusätzlich konnten wir so mikroskopische Zustände transienter Komplexe identifizieren. Das komplette kinetische System können wir mit einer erweiterten Hidden Markov Analyse sowohl im Gleichgewicht als auch im Nichtgleichgewicht analysieren. Insgesamt konnten wir mit Hilfe dieses Instruments schon jetzt einzigartige mechanistische Einblicke in die Hsp90-basierte Proteinmaschinerie gewinnen.
Publications
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A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods in Enzymology, 487-516. Elsevier.
Götz, M.; Wortmann, P.; Schmid, S. & Hugel, T.
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Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophysical Journal, 113(8), 1711-1718.
Wortmann, Philipp; Götz, Markus & Hugel, Thorsten
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Conformational Dynamics of a Single Protein Monitored for 24 h at Video Rate. Nano Letters, 18(10), 6633-6637.
Ye, Weixiang; Götz, Markus; Celiksoy, Sirin; Tüting, Laura; Ratzke, Christoph; Prasad, Janak; Ricken, Julia; Wegner, Seraphine V.; Ahijado-Guzmán, Rubén; Hugel, Thorsten & Sönnichsen, Carsten
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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. Journal of Visualized Experiments(131).
Götz, Markus; Wortmann, Philipp; Schmid, Sonja & Hugel, Thorsten
