Using Yeats Pheromones for the control of biotechnological processes
Final Report Abstract
Mikrobielle Konsortien bieten in biotechnologischen Prozessen einige Vorteile – insbesondere hinsichtlich der Katalyse hochkomplexer, mehrstufiger Reaktionen sowie hinsichtlich der Langzeitstabilität – und stellen daher eine attraktive Alternative zu Reinkulturen dar, die industrielle Prozesse der Biotechnologie nach wie vor stark dominieren. Ein wesentlicher Nachteil mikrobieller Konsortien ist das Fehlen geeigneter Kontrollelemente, um die Proliferation und metabolischen Leistungen der einzelnen Subpopulationen koordinieren und individuell modulieren zu können, sodass ein reproduzierbarer und hochgradig kontrollierter Prozess ermöglicht wird. Ziel dieses Projektes war die Etablierung von entsprechenden Kontrollelementen für mikrobielle Konsortien unter Verwendung einer synthetischen Zell-Zell-Kommunikation auf der Basis des Hefe-Pheromonsystems. Dabei sollte ein System etabliert werden, dass eine kommunikationsgesteuerte Aktivierung spezifischer Subpopulationen (derjenigen Zelltypen, deren Aktivität für den nächsten Reaktionsschritt der Biokonversion erforderlich ist) bzw. eine kommunikationsgesteuerte Inaktivierung spezifischer Subpopulationen (derjenigen Zelltypen, deren metabolische Aktivität für den biotechnologischen Prozess nicht mehr erforderlich ist) erlaubt. Dafür wurden Hefe-Zellen der Bäckerhefe S. cerevisiae sowie der Spalthefe S. pombe gentechnisch modifiziert, sodass infolge der Pheromonantwort entweder ihre Proliferation und der Metabolismus aktiviert wird (Aktivierungsmodule) oder ihr Wachstum arretiert wird und die Zellen in den Zelltod übergehen (Inaktivierungsmodule). Für beide Hefen konnten kommunikationsgesteuerte Aktivierungsmodule entwickelt werden, die die Pheromonantwort an die Histidin-Biosynthese koppeln und somit ein Pheromon-abhängiges Wachstum auf Histidin-freien Minimalmedien ermöglichten. Außerdem konnten Pheromon-gesteuerte Inaktivierungsmodule für beide Spezies etabliert werden, wobei die Pheromonantwort zur Expression einer Restriktionsendonuklease führte, die die zelluläre DNA fragmentiert und somit zur Wachstumsinhibierung führt. Somit konnte gezeigt werden, dass eine funktionelle Kopplung der Pheromonantwort an wachstumsfördernde und wachstumsinhibierende synthetisch-biologische Module in verschiedenen Hefe-Spezies möglich ist. Die Funktionalität der Aktivierungs- und Inaktivierungsmodule in S. cerevisiae konnte mithilfe von Halo-Assays und Co-Kultivierungen nachgewiesen werden. Insbesondere die Co-Kultivierungen, in denen das Wachstumsverhalten Pheromon-responsiver Zellen durch die Pheromonsekretion einer zweiten Subpopulation moduliert werden konnte, stellen eine direkte Grundlage für den Transfer dieses Systems in einen biotechnologisch relevanten Maßstab (d.h. in Bioreaktoren) dar. Co-Kultivierungen von S. pombe bzw. von S. cerevisiae und S. pombe in einem gemeinsamen System konnten nicht erfolgreich umgesetzt werden – weitere Untersuchungen zur Identifikation geeigneter Kulturmedien und Kultivierungsbedingungen sind hierfür erforderlich. Die wesentlichen Projektziele hinsichtlich der kommunikationsgesteuerten Kontrolle des Wachstumsverhaltens individueller Subpopulationen in mikrobiellen Konsortien konnten erreicht werden. Im Rahmen eines Folgeprojektes soll analysiert werden, inwiefern das hier entwickelte System auf weitere biotechnologische Fragestellungen übertragen werden kann.
Publications
- Hefezellen als Sensoren und Aktoren in zellulären Netzwerken. Dresdner Transferbrief 2016, 2.16:6
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- Hydrophobin-Based Surface Engineering for Sensitive and Robust Quantification of Yeast Pheromones. Sensors (Basel). 2016, 16(5):E602
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(See online at https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.11.002)
