Charakterisierung von Adapterproteinen und posttranslationalen Modifikationen in alternativen Telomerverlängerungsmechanismen durch Proteomik

• Antragsteller: Dr. Falk Butter
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 276233163

Telomerasenegative Tumorzellen verwenden gezielte Mechanismen, um dem replikativen Verkürzen der Telomere entgegenzuwirken. Diese Mechanismen werden zusammenfassend als Alternative Telomerverlängerung (alternative lengthening of telomeres, ALT) bezeichnet.Es ist allgemein akzeptiert, dass die meisten, wenn nicht sogar alle, ALT-Mechanismen homologe Rekombination verwenden, um die Telomerlänge zu erhalten. Jedoch ist der genaue molekulare Mechanismus unbekannt. Viele ALT-Zellen weisen charakteristische Eigenschaften, wie Telomerlängenheterogenität, einen hohen Grad von Telomeraustauschen von Schwesterchromatiden und eine nukleäre Struktur, welche als ALT-assoziierte PML-Körper (ALT-associated PML body, APB) bezeichnet wird, auf. PML-Körper sind makromolekulare Strukturen, die ubiquitär in den meisten Zelltypen auftreten. Diese Körper sind an verschiedensten Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Interaktionen beteiligt. Die Interaktion von PML-Körpern mit den Chromosomenextremitäten ist jedoch ein charakteristisches Merkmal von ALT-Zellen. Durch diesen Kontakt der Telomere mit den PML-Körpern wird die nach der Replikation stattfindende Rekombination in der S/G2 Phase begünstigt. Wie diese Regulation jedoch räumlich und zeitlich erreicht wird, ist bisher unbekannt. Wir spekulieren, dass entweder Adapterproteine eine Brücke zwischen Telomeren und PML-Körpern bilden oder spezielle posttranslationale Modifikationen von konstitutiven telomerbindenden Proteinen dafür notwendig sind. Beide Möglichkeiten sollen hier untersucht werden. Wir schlagen in diesem Antrag einen innovativen Ansatz basierend auf der Verwendung des PML-Körper infiltrierenden Herpesvirusprotein ICP0 für die Aufreinigung sowie eine anschliessende genaue Charakterisierung der Bindeproteine mit Hilfe von moderner quantitativer Proteomik vor. Die Analyse, der aus diesem Verfahren erhaltenen Informationen soll eine Definition des Telosom-PML-Körperkomplexes in ALT-Zellen ermöglichen. Ferner wollen wir mit hochauflösender Massenspektrometrie eine erste umfassende Kartierung von posttranslationalen Modifikationen von telomerassoziierten Proteinen in ALT-Zellen durchführen. Die meisten posttranslationalen Modifikationen, die bislang in der Literatur beschrieben sind, wurden nur in telomerasepositiven Zelllinien untersucht. Es ist bisher unbekannt, ob diese Modifikationen auch in ALT auftreten und welche Rolle sie in ALT-Zellen spielen. Wir erwarten, dass die gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis für die in ALT auftretenden Mechanismen führen. In diesem Antrag vereinen wir die Expertise in ALT-Telomerbiologie (Draskovic and Boussin), einer neuen Aufreinigungsstrategie (Draskovic), einer ausgewählten Gliomastammzellliniensammlung als Modell (Boussin) und der Erfahrung in massenspektrometriebasierter Proteomik (Butter), um zu erforschen, was ein ABP beinhaltet und wie seine Bildung reguliert wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Kooperationspartner: Dr. Francois Boussin, Ph.D.; Dr. Arturo Londono-Vallejo