Identifikation und Charakterisierung von Mutanten des Phytinsäure-Syntheseweges in Raps

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Jung
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenzüchtung, Pflanzenpathologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277148037

Phytinsäure spielt als Phosphatspeicher in Pflanzen eine große Rolle. Obwohl eine Vielzahl von Phytinsäure-Synthese- und Transportgenen in unterschiedlichen Kulturarten identifiziert wurden, sind die Erkenntnisse über Bedeutung, genaue Anzahl und organspezifische Expression der einzelnen Gene in einigen Kulturpflanzen wie Raps noch sehr lückenhaft. Dieses Projekt dient dazu, die beteiligten Gene zu identifizieren und zu analysieren. Gleichzeitig sollen Mutanten erzeugt, identifiziert und als Prototypen für die Rapszüchtung eingesetzt werden.Im ersten Schritt soll daher über eine systematische vergleichende Sequenzanalyse in Rapsdatenbanken die Identifizierung möglichst aller im Raps vorhandenen Phytinsäuresynthese-Gene erfolgen, für die dann Expressionsdaten in Blatt- und Samengewebe erhoben werden. Unser Fokus liegt dabei auf der Phytinsäureakkumulation in Rapssamen, da die hohen Phytinsäuregehalte in Rapssaat die Nutzung des äußerst proteinreichen, entölten Schrotes in der Tier- oder Humanernährung erheblich einschränken.Nach der Identifizierung der beteiligten Gene aus der in-silico Analyse streben wir in eine TILLING by Sequencing-Isolation von Phytinsäure-Synthese- und Transportergen-Mutanten aus einer EMS-mutagenisierten Winterrapspopulation an, die missense- oder nonsense-Mutationen enthalten und damit zum Funktionsverlust des Enzym- oder Transporterproteins führen können. In diesem nicht-transgenen Ansatz sollen durch Kreuzungen einzelner Mutanten Niedrig-Phytinsäure-Prototypen für die Pflanzenzüchtung erzeugt werden. Parallel dazu werden gezielt Mutationen in Phytinsäuresynthese-Genen mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technik erzeugt.Unser Ansatz eines Mutanten-Screenings über Illumina-Sequenzierung ermöglicht es, in einem Hochdurchsatzverfahren eine Vielzahl von Mutationen in allen betroffenen Synthesegenen gleichzeitig zu detektieren und damit eine Vielzahl von Mutanten für physiologische Studien zu erzeugen. In ausgewählten Phytinsäure-Mutanten sollen dann während der Samenreife die Expression einzelner Gene, die Enzym- bzw. Transporteraktivität und die Phytinsäure-Akkumulation gemessen werden. Darüber hinaus soll über die Quantifizierung der Inositol-Phosphat-Zwischenprodukte, des freien Phosphats und des Gesamt-Phosphats eine Phosphatbilanz erstellt und im Vergleich mit den über CRISPR/Cas9 ausgeschalteten Gene eine Bewertung der Stoffwechselflüsse bzw. alternativer Synthesewege erfolgen. Enzymkinetische Messungen nach Überexpression der entsprechenden Gene in E. coli sollen diese Ergebnisse absichern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Dr. Hans-Joachim Harloff