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Projekt
Neue DNA-Polymerasen zur direkten Detektion von epigenetischen Markierungen in RNA
Antragsteller
Professor Dr. Andreas Marx
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Förderung
Förderung von 2015 bis 2022
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277366853
Der Blick auf Nukleinsäuren als ausschließlicher Träger von Sequenzinformation ist ungenau. RNA weißt einen beträchtlich breiteren Bereich zellulärer Funktionen auf, einschließlich der Katalyse biochemischer Reaktionen, der Kontrolle posttranskriptionaler Modifikationen und der Regulation der Genexpression. In der Tat wurden mehr als 150 enzymatisch eingeführte und chemisch unterschiedliche Nukleotidmodifikationen in zellulärer RNA identifiziert. Modifizierte Nukleotide erhöhen die strukturelle Vielseitigkeit und chemische Diversität von RNA-Molekülen, um deren vielfältige zelluläre Funktionen zu ermöglichen. Auf diese Weise können sie die RNA-Faltung, sowie RNA-RNA- und RNA-Protein-Interaktionen fein abstimmen. Darüber hinaus wurden hochdynamische Nukleotidmodifikationen in Protein-kodierenden RNAs entdeckt, die den mRNA-Metabolismus kontrollieren sollen und dadurch die Genexpression regulieren.Ein Engpass auf diesem Gebiet besteht darin, dass verfügbare Verfahren zum hochpräzisen Nachweis dieser Modifikationen sehr mühsam sind und dadurch den Fortschritt behindern. Das Ziel dieses Projektes ist es, breit anwendbare Methoden zu entwickeln, die einen zuverlässigen Nachweis von RNA-Modifikationen innerhalb der RNA ermöglichen. In der ersten Förderphase war es uns gelungen, eine Reverse Transkriptase zu entwickeln, die spezifische reverse Transkriptions (RT)-Signaturen als Reaktion auf eine m6A-RNA-Modifikation aufweist. In enger Zusammenarbeit mit der Gruppe von Mark Helm (Mainz) und Yuri Motorin (Nancy) konnten wir zeigen, , dass das „evolvierte“ Enzym an m6A-Stellen in verschiedenen Sequenzkontexten markante RT-Signaturen liefert, während es gegenüber unmodifizierten Nukleotiden und den meisten anderen modifizierten Nukleotiden keine erhöhten Fehlerraten aufweist. Dies ermöglicht die Kartierung von m6A-Stellen durch Sequenzierung der nächsten Generation.In der nächsten Förderphase zielen wir auf a) die Optimierung des entwickelten Enzyms der 1. Generation zur Ermöglichung breiter Anwendungen beim Nachweis von m6A-Stellen und b) die Generierung einer reversen Transkriptasevariante, die auf Pseudouridin anspricht. Es wurde vorgeschlagen, dass die Pseudouridinylierung in mRNA wichtige regulatorische Rollen im mRNA-Metabolismus ausübt, und daher werden zuverlässige Techniken, die den Nachweis von Pseudouridin ermöglichen, das Feld anspornen. Dabei werden wir die experimentellen Routen verfolgen, die in der ersten Förderphase entwickelt wurden, einschließlich des kombinatorischen Proteindesigns, des Screenings und der biochemischen Charakterisierung. Am Ende des Projekts werden wir in der Lage sein, der Fachgemeinschaft Enzyme zur Verfügung zu stellen, die auf den ortsselektiven Nachweis von m6A und Pseudouridin zugeschnitten sind und für zukünftige Anwendungen von Nutzen sein werden. Darüber hinaus haben wir mehr Einblick in die Funktion einer DNA-Polymerase erhalten, die in vielen biotechnologischen Anwendungen zum Einsatz kommt.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
