Investigation of the structure function relationships within the superfamilies of PLP-dependent transaminases
Final Report Abstract
Im Rahmen dieser DFG-Förderung wurden beide Teilprojekte (Bornscheuer: Analyse von Struktur- Funktionsbeziehungen von Transaminasen; Höhne: Vorhersage und Charakterisierung von Enzymaktivitäten mittels molekularem Modelling) erfolgreich bearbeitet. Eine zentrale Frage war es, die Substratspezifität von Transaminasen zu verstehen. Durch Nutzung einer breiten Palette von Methoden des Protein-Engineerings gelang es erstmalig eine α-Aminosäuretransaminase (DATA) in eine Amintransaminase (ATA) zu überführen, sodass die DATA- Variante nun in der Lage ist (R)-1-Phenylethylamin aus Acetophenon zu bilden. Diese Erkenntnisse erlauben nun ein vertieftes Verständnis über die Struktur-Funktionsbeziehungen und den evolutiven Prozess zur Entstehung dieser Enzymaktivität. In Zusammenarbeit mit der Fa. Quantumzyme (Indien) gelang es durch molekulardynamische Untersuchungen in Kombination mit QM-Berechnungen am Beispiel der ATA aus Chromobacterium violaceum Positionen zu identifizieren, bei denen über diese Berechnungen vorgeschlagene Mutationen zur Akzeptanz räumlich anspruchsvoller Ketone und stereoselektiven Bildung der entsprechenden chiralen (S)-Amine führten. Zwei Doppelmutanten (F88L/C418(G/L)) zeigten eine bis zu 200-fach erhöhte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp. In einem weiteren Teilprojekt erlaubte eine detaillierte bioinformatische Analyse mittels des 3DM-Tools eine genaue Vorhersage der Aktivitäten von Enzymen aus der PLP-Faltungsklasse I (Subfamilie der Ornithin-TA) und die Ableitung von zuverlässigen Aminosäuresequenz-Mustern („fingerprints“), welche in der Nähe des aktiven Zentrums an der Ausprägung der Reaktions- und Substratspezifität beteiligt sind. Die im Antrag aufgestellte Hypothese, dass das Niveau der ATA-Aktivität mit der Polarität des aktiven Zentrums korreliert, konnte erfolgreich am Beispiel von Enzymen aus den Subfamilien 3FCR bzw. 3HMU experimentell bestätigt werden. Die in einem weiteren Arbeitspaket postulierte Steigerung der Aktivität üblicher ATA (um den Faktor 100) konnte sehr erfolgreich bearbeitet werden. So gelang es die Aktivität der ATA 3FCR durch kombinatorische Mutagenese bis zu 8900-fach zu erhöhen und zudem die strukturellen Faktoren zu identifizieren, welche für diese enorme Aktivitätssteigerung verantwortlich sind. Schließlich gelang es durch umfangreiche bioinformatische Studien auch die "Grauzone"-Kandidaten innerhalb der ATA-Familie bzgl. deren Funktion zu analysieren und biochemisch zu charakterisieren. Dies führte u.a. zur erstmaligen Belegung der ATA-Aktivität für das Protein 3N5M aus Bacillus anthracis und zur Identifizierung eines weiteren Enzyms mit außergewöhnlich hoher Thermoaktivität und -stabilität. Zusätzlich konnten die im Rahmen dieses Projektes identifizierten Transaminasen erfolgreich auch in Kooperationsvorhaben mit externen Partnern erfolgreich eingesetzt werden. Die große Toolbox an Enzymen und unser hierdurch erworbenes vertieftes Verständnis über die Struktur-Funktionsbeziehungen erlaubte es so beispielsweise b-Aminosäureester, Aminozucker und Amino-Fettsäuren erstmalig selektiv herzustellen. Die im Antrag formulierten Hypothesen konnten bestätigt und alle Ziele erreicht werden.
Publications
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