Photon-upconversion nanoparticles as background-free luminescent labels in single molecule immunoassays
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war es, einen Einzelmolekül-Immunoassay zu entwickeln, der die Beschränkungen bisheriger Fluoreszenz-basierter Einzelmolekültechniken umgeht, einfacher durchzuführen ist und im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays wesentlich empfindlicher ist. Dies ist durch Verwendung Photon-Aufkonvertierender-Nanopartikel (UCNP) als Lumineszenzmarkierung gelungen. Unter Nah-Infrarot-Beleuchtung emittieren UNCPs kürzerwelliges Licht (anti-Stokes-Emission), was Hintergrundfluoreszenz und Lichtstreuung biologischer Materialien weitgehend vermeidet. Zusätzlich zum optischen Hintergrund vermied die Passivierung der UCNPs durch einen neu entwickelten PEG-basierten Linker eine nichtspezifische Bindung der UCNPs an Oberflächen. Ein Weitfeld-Aufkonversions-Mikroskop zum Nachweis von UCNPs auf der Ebene einzelner Nanopartikel wurde schrittweise optimiert, um einzelne UCNP-markierte Immunokomplexe im Mikrotiterplatten-Format sichtbar zu machen und digital auszulesen. Dieser Mikroskopaufbau ermöglichte den digitalen Nachweis des Krebsmarkers Prostata-spezifisches Antigen (PSA), eines Markers für Myokardinfarkt (kardiales Troponin) und des N-Proteins aus Covid-19. Es war generell eine deutliche Verbesserung der Nachweisgrenze (>100x) im Vergleich zum ELISA feststellbar. Der Vorteil des digitalen Auslesens im Vergleich zum analogen Auslesen des ULISA hing dagegen überraschend stark von der Verfügbarkeit hochaffiner Antikörper ab. Im Fall von PSA erreichte das digitale Auslesen eine Nachweisgrenze im subfemtomolaren Bereich (800 aM) und macht den digitalen Immunoassay somit zu einem der empfindlichsten bisher beschriebenen Tests. Darüber hinaus ist der Mikroskopaufbau hervorragend für die Hintergrund-freie Bildgebung geeignet, denn der immunocytochemische Nachweis des Brustkrebsmarkers HER2 durch UCNPs ermöglichte ein Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von mehr als 300. Somit trug dieses Projekt dazu bei, UCNPs in der klinischen Diagnostik sowohl für hochempfindliche Immunoassays als auch für die Pathologie verfügbar zu machen.
Publications
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Single Molecule Upconversion-Linked Immunosorbent Assay with Extended Dynamic Range for the Sensitive Detection of Diagnostic Biomarkers. Analytical Chemistry, 89(21), 11825-11830.
Farka, Zdeněk; Mickert, Matthias J.; Hlaváček, Antonín; Skládal, Petr & Gorris, Hans H.
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Large-Scale Purification of Photon-Upconversion Nanoparticles by Gel Electrophoresis for Analogue and Digital Bioassays. Analytical Chemistry, 91(2), 1241-1246.
Hlaváček, Antonín; Mickert, Matthias J.; Soukka, Tero; Lahtinen, Satu; Tallgren, Terhi; Pizúrová, Naděžda; Król, Anna & Gorris, Hans H.
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Farka, Zdeněk; Mickert, Matthias J.; Pastucha, Matěj; Mikušová, Zuzana; Skládal, Petr & Gorris, Hans H.
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Peltomaa, Riikka; Farka, Zdeněk; Mickert, Matthias J.; Brandmeier, Julian C.; Pastucha, Matěj; Hlaváček, Antonín; Martínez-Orts, Mónica; Canales, Ángeles; Skládal, Petr; Benito-Peña, Elena; Moreno-Bondi, María C. & Gorris, Hans H.
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Surface design of photon-upconversion nanoparticles for high-contrast immunocytochemistry. Nanoscale, 12(15), 8303-8313.
Farka, Zdeněk; Mickert, Matthias J.; Mikušová, Zuzana; Hlaváček, Antonín; Bouchalová, Pavla; Xu, Wenshu; Bouchal, Pavel; Skládal, Petr & Gorris, Hans H.
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Effect of Particle Size and Surface Chemistry of Photon‐Upconversion Nanoparticles on Analog and Digital Immunoassays for Cardiac Troponin. Advanced Healthcare Materials, 10(18).
Brandmeier, Julian C.; Raiko, Kirsti; Farka, Zdeněk; Peltomaa, Riikka; Mickert, Matthias J.; Hlaváček, Antonín; Skládal, Petr; Soukka, Tero & Gorris, Hans H.
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Bioconjugates of photon-upconversion nanoparticles for cancer biomarker detection and imaging. Nature Protocols, 17(4), 1028-1072.
Hlaváček, Antonín; Farka, Zdeněk; Mickert, Matthias J.; Kostiv, Uliana; Brandmeier, Julian C.; Horák, Daniel; Skládal, Petr; Foret, František & Gorris, Hans H.
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Digital and Analog Detection of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein via an Upconversion-Linked Immunosorbent Assay. Analytical Chemistry, 95(10), 4753-4759.
Brandmeier, Julian C.; Jurga, Natalia; Grzyb, Tomasz; Hlaváček, Antonín; Obořilová, Radka; Skládal, Petr; Farka, Zdeněk & Gorris, Hans H.
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Upconversion‐Linked Branched DNA Hybridization Assay for the Detection of Bacteriophage M13. Advanced Optical Materials, 13(2).
Brandmeier, Julian C.; Kuusinen, Saara; Farka, Zdeněk; Soukka, Tero & Gorris, Hans H.
