Proteolytic ceramic capillary membranes for the preparative production of bioactive peptides
Final Report Abstract
Peptide stellen eine der wirksamsten Stoffgruppen in lebenden Organismen dar. Sie werden durch Hydrolyse der Nahrungsmittelproteine erzeugt und im Gastrointestinaltrakt vom Körper resorbiert. Die Funktionen dieser besonderen Gruppe von "bioaktiven" Peptiden reichen von blutdrucksenkend über antioxidativ, blutverdünnend, cholesterinsenkend, antimikrobiell bis hin zu immunmodulierend. Ein großer Teil der bioaktiven Peptide wurde bis heute nicht systematisch identifiziert und charakterisiert, auch eine genaue Zuordnung zur ursprünglichen Proteinquelle ist bisher nur selten möglich. Eine systematische Untersuchung dieses sog. Proteolysoms hat bis heute nur für Milchproteine und daraus abgeleitete Peptide stattgefunden. In der ersten Projektphase wurden zu diesem Zweck tubuläre Keramik-kapillarreaktoren entwickelt, auf denen verschiedene Proteasen aktiv immobilisiert wurden, vor allem die Serinprotease Alkalase zeichnete sich durch eine hohe proteolytische Aktivität aus. Entscheidender Vorteil dieses Systems ist die exakt reproduzierbare und genau einstellbare Herstellung spezifischer Peptid-Kompositionen ("Peptidfingerprints") in Abhängigkeit definierter Reaktionsbedingungen. Die erzeugten Peptide wurden im präparativen Maßstab chromatographisch fraktioniert und aufgereinigt. Das Reaktorsystem ermöglicht die kontinuierliche Prozessierung für enzymatische Hydrolysen. Grundsätzlich können verschiedenste hydrolytische Enzyme auf den funktionalisierten, hochporösen Keramik-Kapillarmembranen immobilisiert werden, die anschließend von dem umzusetzenden Substrat durchströmt werden. Hierbei gelangt das immobilisierte Enzym nicht in das Hydrolyseprodukt. Durch Regulation der Parameter Flussrate, Temperatur und pH-Wert können die optimalen Bedingungen für die jeweilige enzymatische Reaktion exakt eingestellt werden. Um das Reaktorsystem im Folgeprojekt als eine Plattformtechnologie für kontinuierliche, enzymatische Hydrolyseprozesse zu etablieren, wurde es so aufgebaut, dass es der kontinuierlichen Hydrolyse verschiedener Substrate mithilfe enzym-immobilisierter Keramik-Kapillarmembranen dient. In diesem System können die Flussrate und Temperatur des Kapillarmembranreaktors präzise und optimal eingestellt werden. Zusätzlich ermöglicht das System die Kühlung des Substrat-Feeds und des Hydrolyseproduktes, welches fraktioniert gesammelt werden kann. Dies gewährleistet eine hohe Prozessstabilität über einen langen Zeitraum, da die Aggregation von Proteinen im Substrat-Feed sowie der thermische Zerfall der Hydrolyseprodukte mit der Zeit deutlich minimiert werden. Das System wurde für drei weitere hydrolytische Anwendungen eingesetzt und hinsichtlich der Langzeit-Stabilität untersucht. In der ersten Anwendung wurde humanes Immunglobulin G mithilfe der Cysteinprotease Papain selektiv in seine Fab- und Fc-Fragmente gespalten. Die zweite Anwendung beschäftigte sich mit der Abspaltung der Fusionsdomäne eines GST-GFP-Fusionsproteins mithilfe von immobilisierter TEV-Protease. In der dritten Anwendung wurde die enzymatische Gewinnung von Invertzucker aus Saccharose untersucht. Hierbei kam die Invertase zum Einsatz, die ebenfalls zur Klasse der Hydrolasen gehört. Sie katalysiert die Spaltung des Disaccharids Saccharose in die Monosaccharide Glucose und Fructose. Das entwickelte Reaktorsystem wurde außerdem zum Mehrkapillarmodul weiter aufskaliert und auch die Kombination verschiedener Module in Reihenschaltung wurde getestet. Insgesamt konnte das entwickelte Keramikkapillarreaktorsystem erfolgreich als Plattformtechnologie für proteolytische Anwendungen etabliert werden.
Publications
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Flow rate dependent continuous hydrolysis of protein isolates. AMB Express, 8(1).
Sewczyk, Tim; Hoog, Antink Marieke; Maas, Michael; Kroll, Stephen & Beutel, Sascha
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Proteolytic ceramic capillary membranes for the production of peptides under flow. Biochemical Engineering Journal, 147, 89-99.
Hoog, Antink Marieke M.; Sewczyk, Tim; Kroll, Stephen; Árki, Pál; Beutel, Sascha; Rezwan, Kurosch & Maas, Michael
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Enzymatische Hydrolyseprozesse im kontinuierlich betriebenen Keramikkapillarreaktor. Chemie Ingenieur Technik, 92(9), 1213-1213.
Messner, L.; Antink, M.; Guo, T.; Maas, M. & Beutel, S.
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Tailoring electrostatic surface potential and adsorption capacity of porous ceramics by silica-assisted sintering. Materialia, 12, 100735.
Hoog, Antink Marieke M.; Beutel, Sascha; Rezwan, Kurosch & Maas, Michael
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A versatile ceramic capillary membrane reactor system for continuous enzyme‐catalyzed hydrolysis. Engineering in Life Sciences, 21(8-9), 527-538.
Messner, Lorn; Antink, Marieke H.; Guo, Tongwei; Maas, Michael & Beutel, Sascha
