Hybrid-Triple Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer
Final Report Abstract
Charakterisierung bioaktiver Lebensmittelinhaltsstoffe Der Transkriptionsfaktor Nrf2 reguliert die Expression cytoprotektiver Proteine, die Zellen vor oxidativem Stress schützen. Mit dem finanzierten Gerät konnte eine hochselektive LC-MS/MS Methode entwickelt und etabliert werden, die die direkte Analyse des Transkriptionsfaktors Nrf2 ermöglicht. Die Methode basiert auf drei spezifischen Nrf2-Peptiden, die durch enzymatische Hydrolyse in einem in-Gel-Verdau freigesetzt werden. Das Verfahren wurde anschließend auf vier verschiedene Zielllinien (HepG2, SH-SY5Y, PC12 und Caco-2) angewendet und Nrf2 im nukleären Proteinextrakt relativ und absolut mit Hilfe eines isotopenmarkierten Standards quantifiziert. Im Vergleich zu klassischen bioanalytischen Verfahren wie beispielsweise dem Western Blot, zeichnet sich die neue LC-MS/MS Methode durch eine höhere Präzision aus und erlaubt eine eindeutige Verifizierung des Analyten (Östreicher C, Gensberger-Reigl S, Pischetsrieder M, Targeted mass spectrometry to monitor nuclear accumulation of endogenous Nrf2 and its application to SH-SY5Y cells stimulated with food components. Analytical and Bioanalytical Chemistry (2019) 411:1273–1286; https://doi.org/10.1007/s00216-018-1560-2;). Weiterhin kann mittels dieser neuen Methode die cytoprotektive Wirkung verschiedener Lebensmittelinhaltsstoffe gezielt auf der Ebene des Transkriptionsfaktors Nrf2 untersucht werden (Östreicher C, Untersuchung der Aktivierung des Nrf2- Signalwegs durch Lebensmittelinhaltsstoffe mittels gerichteter massenspektrometrischer Proteinanalytik, Dissertation FAU Erlangen-Nürnberg, 2017). Authentizitätsnachweis von ESL-Milch und pasteurisierter Milch Rohmilch und Rohmilchprodukte sind aufgrund ihrer mikrobiologischen Konstitution und inhärenter Enzyme nur bedingt haltbar. Um die Stabilität der Produkte zu verbessern, werden diese thermisch behandelt. Hierfür werden unterschiedliche Verfahren eingesetzt. Während das Ultrahocherhitzungsverfahren (UHT) nahezu alle Mikroorganismen abtötet (UHT-Milch oder H-Milch), handelt es sich bei der Pasteurisierung um eine sehr schonende Erhitzung, bei dem vor allem pathogene Keime abgetötet werden. Die Lücke zwischen diesen beiden Technologien füllt die sog. ESL-Milch (extended shelf life). Das finanzierte LC-MS/MS Gerät wurde zur Entwicklung eines Vorhersagemodells für die Authentizitätskontrolle pasteurisierter Milch eingesetzt. Dieses erlaubte sogar die Unterscheidung zwischen Pasteurisierung und ESL-Behandlung, obwohl beide sehr schonende Erhitzungsverfahren darstellen. Hierzu wurde eine LC-MS/MS Methode entwickelt, die die Sequenzierung von Markerpeptiden ermöglichte. Die Markerpeptide wurden zuvor mittels MALDI-TOF-MS und chemometrischen Verfahren ermittelt (Dalabasmaz S, Pischetsrieder M, Design of a prediction model for the differentiation of pasteurized milk from ESL milk by peptide profiling, Proteomics 2019, 1800292, https://doi.org/10.1002/pmic.201800292; Dalabasmaz S, Peptidprofilanalyse zur Beurteilung der Hitzebehandlung und Lagerung von Milch, Dissertation FAU Erlangen-Nürnberg 2018). Dieses Verfahren seht nun zur Verfügung, um Prozesse zu optimieren oder Qualitätsparameter zu kontrollieren. Weiterhin kann es genutzt werden, um die Authentizität von Milch zu prüfen. Antimikrobielle Peptide in Lebensmitteln Der mikrobielle Verderb von Lebensmitteln führt zu einer hohen Anzahl an Erkrankungen, die sogar zum Tod führen können (ca. 350.000 Todesfälle pro Jahr, Quelle: WHO). Daher ist die Identifizierung von neuartigen antimikrobiellen Wirkstoffen von großer Bedeutung und Aktualität. Antimikrobielle Wirkstoffe, die aus Lebensmittel gewonnen werden, gelten hierbei als besonders sicher. Peptide stellen dabei eine sehr interessante Verbindungsklasse dar, da bereits ihre Struktur-Wirkungsbeziehung bekannt ist und somit die Wirkung einer definierten Peptidsequenz mittels bioinformatischer Methoden vorhergesagt werden kann. Mit Hilfe des LC-MS/MS Geräts wurden die Peptidprofile pflanzlicher Rohstoffe untersucht und mittels Totalionen- und Fragmentionen-Scans die Peptide sequenziert. Auf Basis dieser Voruntersuchungen wurde die Kichererbse als besonders erfolgversprechende Peptidquelle ausgewählt. Es wurden insgesamt 21 potenzielle antimikrobielle Peptidsequenzen identifiziert, die anschließend synthetisiert und mit Hilfe des LC-MS/MS Gerätes charakterisiert wurden. Die Bestimmung der antimikrobiellen Wirkung erfolgte mittels bioanalytischer Verfahren. Dabei zeigten zwei Peptide besonders niedrige minimale Hemmstoffkonzentrationen gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen (Heymich et al. Gewinnung von antimikrobiellen Peptiden aus Pflanzen für die Konservierung von Lebensmitteln, 2019, Lebensmittelchemie, im Druck).
Publications
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Establishment and application of mass spectrometry-based methods of targeted and untargeted proteomics for the determination of the expression profile of secreted proteins : Entwicklung und Anwendung Massenspektrometrie-basierter Methoden der gerichteten und ungerichteten Proteomanalyse zur Bestimmung des Expressionsprofils sekretierter Proteine, Dissertation, Friedrich- Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Emirbayer P. E.
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Untersuchung der Aktivierung des Nrf2-Signalwegs durch Lebensmittelinhaltsstoffe mittels gerichteter massenspektrometrischer Proteinanalytik, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Östreicher C. M.
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Application of peptide profiling for the evaluation of milk processing and storage : Peptidprofilanalyse zur Beurteilung der Hitzebehandlung und Lagerung von Milch, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dalabasmaz S.
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Design of a Prediction Model for the Differentiation of Pasteurized Milk from Heated ESL Milk by Peptide Profiling. PROTEOMICS, 19(7).
Dalabasmaz, Sevim & Pischetsrieder, Monika
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Targeted mass spectrometry to monitor nuclear accumulation of endogenous Nrf2 and its application to SH-SY5Y cells stimulated with food components. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 411(6), 1273-1286.
Östreicher, Christiane; Gensberger-Reigl, Sabrina & Pischetsrieder, Monika
