Thiol-Oligonukleotide zur reversiblen chemischen Ligation und Replikation
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war es, die Chemie der thiolbasierten Ligationen von Oligonukleotiden umfassend zu untersuchen. Um eine maximale Sequenzauswahl für Thiol-Oligonukleotide zu erreichen, wurde zunächst ein Zugang zu sämtlichen Thiol-nucleosiden realisiert. Hierzu sind in einem ersten Arbeitspaket alle 3‘-Thio-Desoxynukleoside hergestellt worden. Für die 5‘-Thio-Desoxynucleoside wurde auf eine literaturbekannte Methode zur postsynthetischen Modifikation von Oligonukleotiden auf der Festphase zurückgegriffen, wobei die Methode den Anforderungen entsprechend optimiert wurde. Außerdem wurde das Monitoring der Ligationsreaktion mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) verfeinert, indem ein pH-unabhängiges FRET-Quench Detektionssystem entwickelt wurde, das auf dem Farbstoff Alexa488 und einem neu entwickelten Thiorhodol Farbstoff als Quencher-Abgangsgruppe basiert. Dieser neuartige Farbstoff wurde erstmals synthetisiert und seine Anwendbarkeit an einem biologisch relevanten System (RAS-Gen Sequenz) demonstriert. Damit konnte eine Diagnostik entwickelt werden, die eine Detektion in nanomolarer Konzentration mit hoher Empfindlichkeit erlaubt. In einem zweiten Arbeitspaket wurde versucht eine gezielt von außen steuerbare Ligation von Thiol-Oligonucleotiden zu realisieren. Eine sequenzspezifische Aktivierung wurde durch den Einbau von Arylthiol-Modifiern in die DNA erreicht. Ein entsprechendes Phosphoramidit wurde hierzu synthetisiert. Das 5‘-5‘-Disulfid-ODN-Dimer wurde in Ligationsexperimenten erfolgreich als sequenzspezifischer Aktivator eingesetzt. Im dritten Arbeitspaket wurden Untersuchungen zur Polymerisation und Selbstorganisation (Dynamic Libraries) von Thiol-Oligunucleotiden angedacht. In 3‘- und/oder 5‘-Position thiolierte Oligonukleotide sollten bezüglich ihres Verhaltens in Experimenten zur Selbstorganisation untersucht werden. Leider erwies sich die Darstellung von 5‘-3‘-Thiol-ODNs als große Herausforderung und war im Projektzeitraum nicht zu realisieren. Im vierten Arbeitspaket standen die Synthese von Vinylsulfon-Oligonukleotiden und ihre Verwendung für „Thio-Klick“-Ligationen im Mittelpunkt. Hierzu wurden zunächst Oligonukleotiden mit einer 5‘-(2-Hydroxyethylthio)-Modifikation hergestellt und der Thioether nach erfolgter Kopplung mit NaIO 4 (Natriumperiodat) zum Sulfon oxidiert und das resultierende Sulfon-Oligunucleotid isoliert. Unter basischen Bedingungen konnte nun ein Nukleotidrest R als Abgangsgruppe zur Freisetzung des Vinylsulfon-Oligonukleotids eliminiert werden. Vinylsulfon-Oligonukleotide konnten mit der beschriebenen Methode in verschiedenen Sequenzen an allen Nukleosiden (dT, dC, dA, dG) erzeugt werden und ihre Verwendbarkeit in templatgesteuerten Ligationen mit 3‘-Thiol-Oligonukleotiden wurde demonstriert. Das Vinylsulfon konnte auch aus der entsprechenden Vorstufe in situ erzeugt und unmittelbar ligiert werden. In Abhängigkeit von der Nukleotid-Abgangsgruppe R verlief die Ligation dabei unterschiedlich schnell. Es wurde somit gezeigt, dass Sulfon-Oligonukleotide als geschützte Vinylsulfon-Oligonukleotide betrachtet werden können, die unter schwach basischen Bedingungen zur Ligation aktiviert werden.
