The role of transport proteins for the elimination of uremic toxins during chronic kidney disease

• Applicant: Professor Dr. Jörg König
• Subject Area: Nephrology ; Pharmacology ; Cell Biology
• Term: from 2015 to 2018
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 279869257

• Final Report Year: 2019

Final Report Abstract

Im Rahmen dieses Forschungsprojekts sollte die Rolle des Transportproteins OATP4C1, exprimiert in der basolateralen Membran proximaler Tubuluszellen der Niere, für den Export von Urämietoxinen untersucht werden. Mit Hilfe stabil-transfizierter HEK293-Zellen mit der rekombinanten Überexpression des Transporters konnte erstmals das Urämietoxin asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) als Substrat von OATP4C1 charakterisiert werden. Weiterhin konnten auch die strukturell verwandten Substanzen L-Arginin und das kardioprotektive L-Homoarginin als Substrate des Transporters identifiziert und die kinetischen Transportparameter ermittelt werden. Bei der Charakterisierung der stabilen Transfektanten mit dem beschriebenen Substrat Digoxin zeigte sich, dass das OATP4C1-Protein auch in der Lage ist, Substanzen aus Zellen heraus zu transportieren. Dieser Umstand wurde in Effluxuntersuchungen mit den drei neuen Substraten untersucht und es konnte belegt werden, dass OATP4C1 L-Arginin, L-Homoarginin und ADMA auch aus Zellen heraus transportieren kann. Diese Ergebnisse waren zunächst überraschend, doch unter Einbeziehung metabolisierender Enzyme ergibt sich aus diesen Transportdaten ein Modell für die Rolle des OATP4C1-Proteins für die Homöostase des Urämietoxins ADMA und der kardioprotektiven Substanz L-Homoarginin: ADMA wird durch OATP4C1 aus dem Plasma in die proximalen Tubuluszellen transportiert und intrazellulär durch das Enzym DDAH1 in Citrullin und Dimethylamin abgebaut. Umgekehrt wird L-Homoarginin in den proximalen Tubuluszellen durch das Enzym AGAT synthetisiert und OATP4C1-vermittelt in die systemische Zirkulation exportiert. In weiteren Teilprojekten konnten neben Transportern in der basolateralen Membran auch Exportproteine in der apikalen Membran als relevant für den Transport von Urämietoxinen charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass das apikal lokalisierte Transportprotein MATE1 zusammen mit dem basolateralen Aufnahmetransporter OCT2 den vektoriellen Transport des Urämietoxins Trimethylamin-N-Oxid (TMAO) vermittelt. Weiterhin wurden im Rahmen dieses Forschungsprojekts doppelt-transfizierte MDCKII-Zellen etabliert und charakterisiert, welche in der basolateralen Membran das OATP4C1-Protein und in der apikalen Membran die Exportpumpe P-Glykoprotein exprimieren. Mit Hilfe dieses Zellmodells konnte erstmal gezeigt werden, dass ADMA und L-Homoarginin auch Substrate dieser Exportpumpe sind und dass P-Glykoprotein demnach eine Rolle bei der Sekretion von Urämietoxinen zu spielen scheint. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Expression beider Transportproteine bei fortschreitendem Nierenversagen quantifiziert und es konnte gezeigt werden, dass die Expression des OATP4C1-Proteins mit der glomerulären Filtrationsrate korreliert. Zusammen mit den Transportdaten erklären diese Ergebnisse, warum die Plasmakonzentration das Urämietoxins ADMA mit fortschreitendem Nierenversagen ansteigt (verminderter Transport aus dem Plasma in die proximalen Tubuluszellen) wohingegen die Plasmakonzentration des kardioprotektiven L-Homoarginins abnimmt (verminderter Austransport des in den proximalen Tubuluszellen synthetisierten L-Homoarginins in die systemische Zirkulation). Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit den im Rahmen dieses Forschungsvorhabens erzielten Ergebnissen ein Modell zur Rolle des OATP4C1-Proteins für die Homöostase von ADMA und L-Homoarginin etabliert werden konnte, welches Befunde aus epidemiologischen Studien erklärt. Dies zeigt, dass mit dem OATP4C1-Protein eine neue Zielstruktur zur pharmakologischen Intervention im Verlauf des fortschreitenden Nierenversagens identifiziert werden konnte. Ob neben ADMA (und SDMA) auch weitere Urämietoxine Substrate dieses Transportproteins sind und welche Proteine in der apikalen Membran proximaler Tubuluszellen für die Rückresorption von L-Homoarginin und L-Arginin aus dem Primärharn verantwortlich sind, soll in einem Folgeprojekt weiter untersucht werden.

Publications

• (2019) The renal transport protein OATP4C1 mediates uptake of the uremic toxin asymmetric dimethylarginine (ADMA) and efflux of cardioprotective L-homoarginine. PloS one 14 (3) e0213747
  Taghikhani, Emir; Maas, Renke; Fromm, Martin F.; König, Jörg
  
• Assays for analyzing the role of transport proteins in the uptake and the vectorial transport of substances affecting cell viability. Methods Mol. Biol. 1601:123-135 (2017)
  Taghikhani E., Fromm M.F. und König J.
  
• Biomarkers for in vivo assessment of transporter function. Pharmacol. Rev. 70, 246-277 (2018)
  Müller F., Sharma A., König J. und Fromm M.F.
  
• Contribution of Multidrug and Toxin Extrusion Protein 1 (MATE1) to renal secretion of Trimethylamine-N-oxide. Sci. Rep. 8, 6659 (2018)
  Gessner A., König J. und Fromm M.F.
  
• Clinical aspects of transporter-mediated drug-drug interactions. Clin. Pharmacol. Ther. (2019)
  Gessner, A., König, J. und Fromm