Studying insertion, folding and assembly of ion channels at the single molecule level.
Final Report Abstract
Bei unseren Untersuchungen zur Membraninsertion von KcsA konnten wir feststellen, dass im Unterschied zum Pf3 coat Protein, das monomere KcsA ohne Insertase in Liposomen einbauen lässt. Die Lipidzusammensetzung spielt eine kinetische Rolle; die Anwesenheit von negativ geladenen Lipiden erhöhte die Insertionsrate von KcsA. Veränderungen im N-terminalen Bereich des Proteins führten zu einer Reduzierung der Einbaueffizienz auf ca. 50%. Das Assembly zu einem Tetramer erfolgte etwa 8 min nach der Insertion in die Membran. Das erlaubt nun prinzipiell eine genauere Analyse der Vorgänge, wie die Tetramere gebildet werden könnten. Dabei erwies sich allerdings die FRET Analyse mit Mutanten bisher als ungeeignet. Im weiteren Verlauf des Projekts wurde die YidC-abhängige Membraninsertion von Pf3 coat Protein näher untersucht. Es wurden die homologen Insertasen aus Mitochondrien, Chloroplasten und dem endoplasmatischen Retikulum (ER) gereinigt und in Proteoliposomen rekonstituiert. Das Pf3 Protein ließ sich mit allen Insertasen in diesem System in die Membran einbauen. Dies zeigt nun sehr anschaulich, dass die Homologen tatsächlich sich auch funktionell entsprechen. Für das Get1 Protein ist dies besonders erstaunlich, da der Get Komplex aus vielen Komponenten besteht, die für das Targeting zur Membran benötigt werden. Die neuen Erkenntnisse stellen daher einen sehr wichtigen Beitrag zum aktuellen Wissen dar.
Publications
- (2017). Assisted and unassisted protein insertion into liposomes. Biophys. J. 113, 1-6
Kuhn, A., M. Haase and S. Leptihn
(See online at https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.03.027) - (2017). Mechanism of the autonomous and directional membrane insertion of a 2-transmembrane ion channel. ACS Chemical Biology 12, 380-388
Altrichter, S., M. Haase, B. Loh, A. Kuhn and S. Leptihn
(See online at https://doi.org/10.1021/acschembio.6b01085) - (2018). Large conformational changes of a highly dynamic pre-protein binding domain in SecA. Communic.Biol. 1, 130
Ernst, I., M. Haase, S. Ernst, S. Yuan, A. Kuhn and S. Leptihn
(See online at https://doi.org/10.1038/s42003-018-0133-4) - (2018). YidC-mediated membrane insertion. FEMS Microbiol. Lett. 365, (12) fny106
Kiefer, D. and A. Kuhn
(See online at https://doi.org/10.1093/femsle/fny106) - (2019). Crosslinking and reconstitution approaches to study protein transport. The Protein J. 38,229-235
Kuhn, A.
(See online at https://doi.org/10.1007/s10930-019-09842-7) - (2019). Insertion and folding pathways of single membrane proteins guided by translocases and insertases. Science Adv. 5, eaau6824
Serdiuk, T., A. Steudle, S. Mari, S. Manioglu, H.R. Kaback, A. Kuhn and D. Müller
(See online at https://doi.org/10.1126/sciadv.aau6824)
