In situ gelierende Hydrogele zur Regeneration von Knorpel
Biomaterialien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Aufklärung des Effektes von Sulfatierungs- und Oxidationsgrad von Cellulose auf den Charakter von Hydrogelen, die durch Vernetzung über Iminbindungen zu Polyaminen wie Chitosan hergestellt werden, wobei insbesondere intrinsische Eigenschaften wie Vernetzungsgrad, Diffusion von Wasser, Sauerstoffkonzentration, mechanische und bioaktive Eigenschaften der Hydrogele von Interesse waren. Zudem sollten neben Untersuchungen zur Zytotoxizität auch das Freisetzungsverhalten des Wachstumsfaktors TGF-β3 und die chondrogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen untersucht werden. Von der Arbeitsgruppe Fischer an der Technischen Universität Dresden wurden oxidierte Cellulosesulfate synthetisiert. Durch die Einführung von Sulfatgruppen wurden Produkte entwickelt, welche analoge Strukturmerkmale zu natürlichen Glykosaminoglykanen wie Heparin aufweisen, während die Aldehydgruppen für eine intrinsische Vernetzung mit Aminen zur Bildung von Hydrogelen dienen. Durch die Variation der Synthesebedingungen konnten u.a. der Substitutionsgrad, der Ort der Substitution sowie das Molekulargewicht der Derivate gesteuert werden. Die mechanischen Kennwerte, sowie die Kinetik der Gelformation konnten mittels rheometrischer Messungen bestimmt werden und zeigten eine Variation in Abhängigkeit des Substitutionsgrades und des Molgewichts der Derivate. Die weiteren intrinsischen Untersuchungen der physikalischen Eigenschaften der Hydrogele wurden von der Arbeitsgruppe Mäder an der Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg durchgeführt, um Erkenntnisse über Mobilität des Wassers im Hydrogel zu gewinnen. Messungen des pH-Wertes der oxidierten Cellulosesulfate und Hydrogel wurden mithilfe des pH-sensitiven Farbstoffes SNARF-4F durchgeführt und zeigten eine Abhängigkeit vom Oxidationsgrad, während die Homogenität des Hydrogels durch Benchtop-Magnetresonanz-Imaging untersucht wurde. Dabei zeigte sich, dass ein höherer Sulfatgehalt für eine schwächere Bindung des Wassers in der Hydrogelmatrix verantwortlich war, wobei die Diffusion von Wasser in den Hydrogelen nicht eingeschränkt wurde. Die Analyse der Mikroviskositäten im Hydrogel wurde mithilfe von ESR-Spinsonden analysiert, wobei sich Veränderungen in der Polymermobilität nach 28 Stunden und 8 Tagen zeigten. Der Vergleich mit durchgeführten Rheologiemessungen zeigte, dass die Hydrogele zwar innerhalb kurzer Zeit gelieren, aber noch bis zu 24 Stunden nachvernetzen. Nach 8 Tagen setzt ohne Einfluss von außen ein Abbau der Gelsysteme ein. Dabei findet sich auch hier eine Abhängigkeit der Gelierung vom Aldehydgehalt. Daneben wurde an der Entwicklung neuer injizierbarer O2-Detektorsysteme gearbeitet, um den Sauerstoffgehalt und –gradienten in den Hydrogelsystemen berührungslos zu bestimmen. Aufgrund eines Personalwechsels konnte dieser Projektteil jedoch nicht abgeschlossen werden. Zusätzlich war es geplant, die synthetisierten Hydrogele in-vivo in einem Mausmodell zu untersuchen, um deren Abbauverhalten und Entzündungsprozesse zu analysieren. Da bis zum Ende des Projektes jedoch keine stabilen Systeme mit ausreichender chondrogener Aktivität entwickelt werden konnten, war es nicht mehr möglich, diese Untersuchungen durchzuführen. Die weiteren Untersuchungen zum Abbauverhalten, Zytotoxizität und Einbettung von mesenchymalen Stammzellen wurden von der Arbeitsgruppe Groth an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Mehrzahl der oxidierten Cellulosesulfate stark zytotoxisch auf 3T3 Fibroblasten wirkten, was vor allem bei hohen Aldehydgehalten und geringeren Molekulargewichten beobachtet wurde. Zudem ergaben sich bereits bei Formierung der Hydrogele durch Mischung der Derivate mit Carboxymethylchitosan bei der Mehrzahl der Formulierungen eine geringe Stabilität unter physiologischen Bedingungen (in Phosphatpuffer und Zellkulturmedien), welche besonders bei geringen Aldehydgehalten und Kettenlänge der Cellulosederivate beobachtet wurde. Ein höhere Aldehydgehalt zeigten eine höhere Stabilität der Hydrogele, jedoch gleichzeitig auch eine Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen, während ein höheres Molekulargewicht sowohl die Stabilität als auch die Biokompatibilität der Hydrogele erhöhte. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass der chondrogene Wachstumsfaktor TGF-β3 aus diesen Hydrogelen in geringerem Maße als aus einem Vergleichsgels auf Basis vernetzter Gelatine freigesetzt wurde, wobei keine Abhängigkeiten von Sulfatierungs- und Oxidationsgrad nachweisbar war. konnte. Leider war die Formierung und Stabilität der Hydrogele in Zellkulturmedien stark eingeschränkt, so dass nur wenige oxidierte Cellulosesulfate für weitergehende Untersuchungen geeignet waren. Dabei zeigten mesenchymale Stammzellen in den Hydrogelen zwar aus oxidierten Cellulosesulfaten und Carboxymethylchitosan zwar eine Vitalität über mehrere Tage mit sphärischer Morphologie. Jedoch kam es zu einer Abnahme der Zahl vitaler Zellen im Zeitraum von 14 Tagen, während ein Wachstum nicht beobachtet werden konnte. Leider konnte in diesem Untersuchungszeitraum auch keine chondrogenen Differenzierung in den synthetisierten Hydrogelsystemen ermittelt werden, was wir auf eine unzureichende Biokompatibilität der Systeme zurückführen. Weitergehende Untersuchungen mit einem Austausch von Carboxymethylchitosan durch extrazelluläre Matrixproteine, wie Kollagen könnten möglicherweise die Biokompatibilität verbessern, waren jedoch im Rahmen dieses Projektes nicht mehr möglich.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2019) Development of hydrogels based on oxidized cellulose sulfates and carboxymethyl chitosan. Cellulose 26, 7371- 7382
J. Strätz, A. Liedmann, M.-L. Trutschel, K. Mäder, T. Groth, S. Fischer
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s10570-019-02596-6) - (2019) Effect of Sulfation Route and Subsequent Oxidation on Derivatization Degree and Biocompatibility of Cellulose Sulfates. Macromol. Biosci. 20, 1900403
J. Strätz, A. Liedmann, T. Heinze, S. Fischer, T. Groth
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/mabi.201900403) - (2020) Synthesis and Characterization of Oxidized Polysaccharides for In Situ Forming Hydrogels. Biomolecules 10, 1185
M. Muhammad, C. Willems, J. Rodríguez-Fernández, G. Gallego-Ferrer, T. Groth
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/biom10081185) - (2020) Tailored covalently cross-linked hydrogels based on oxidized cellulose sulfate and carboxymethyl chitosan by targeted adjustment of the storage modulus. Cellulose 27, 7535-7542
J. Strätz, S. Fischer
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s10570-020-03279-3) - (2021) Hydrogels based on oxidized cellulose sulfates and carboxymethyl chitosan – studies on intrinsic gel properties, stability and biocompatibility. Macromol. Biosci
C. Willems, M.-L. Trutschel, V. Mazaikina, J. Strätz, K. Mäder, S. Fischer, T. Groth
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/mabi.202100098)
