Transport of Ammonium across Prokaryotic and Eukaryotic Membranes

• Applicant: Professorin Dr. Susana Andrade
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 2006 to 2013
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 28568402

Ammoniumtransport- (Amt-) Proteine bilden eine in nahezu allen Organismen anzutreffende Klasse von Membranproteinen, die eine zentrale Rolle für den interzellulären Transport von Ammoniumionen spielen, der wichtigsten Quelle von Stickstoff für biologische Synthesen. Seit kurzer Zeit sind zwei hoch aufgelöste Kristallstrukturen verfügbar; eine aus dem Gram-negativen Bodenbakterium Escherichia coli und die andere aus unseren eigenen Arbeiten mit dem hyperthermophilen Euryarchaeon Archaeoglobus fulgidus. Obwohl beide Strukturen eine Vielzahl detaillierter Informationen lieferten, blieben grundlegende Fragen zum Transportmechanismus und zum eigentlich transportierten Substrat, NH3 oder NH4+, weitgehend unbeantwortet. Wir schlagen vor, diese Themenbereiche mit unterschiedlichen methodischen Ansätzen zu bearbeiten. Verschiedene amt-Gene aus mehreren Organismen sind mit und ohne funktionell relevante Punktmutationen zu klonieren und in geeigneten Wirten überzuexprimieren. Aktivitätstests des gereinigten Proteins werden entweder mit elektrophysiologischen Methoden oder Stopped-Flow-Kinetiken in Proteoliposomen durchgeführt. Parallel dazu wird die Röntgenkristallographie ein unschätzbares Werkzeug zur Korrelation von Struktur und Funktion sein, mit dem wir letztlich verstehen wollen, wie Amt-Proteine arbeiten. Expression, Aufreinigung und Kristallisationsbedingungen wurden für die drei Amt-Proteine von A. fulgidus (Amt-1, Amt-2 und Amt-3) optimiert, ein System, an dem wir auch das bei vielen Spezies aus allen Organismenreichen beobachtete, mehrfache Vorkommen von amt-Genen untersuchen werden. Die Modulation des Amt-Transports durch kleine, cytoplasmatische PII Proteine, die eine wichtige Rolle in der Regulation des Stickstoffstoffwechsels spielen, wird ein weiterer Teilaspekt des Projekts sein. Neben unserem Schwerpunktinteresse in A. fulgidus planen wir zudem, weitere prokaryotische und eukaryotische Organismen zu untersuchen.

• DFG Programme: Independent Junior Research Groups