Untersuchung der transitiven und systemischen RNA-vermittelten Geninaktivierung in Pflanzen

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Michael Wassenegger
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 286496950

In Pflanzen werden mikro RNAs und small interfering RNAs (siRNAs), auf Argonaute-Proteine (AGOs), die den Hauptbestandteil des sog. RNA-induced silencing complex (RISC) darstellen, geladen. RISC bindet an komplementäre Transkripte und spaltet diese üblicherweise, in einem Prozeß namens RNA interference (RNAi). Nach Spaltung werden die meisten der Ziel-Transkripte abgebaut. Allerdings werden einige Spaltprodukte auch von RNA-dirigierten RNA Polymerasen (RDRs) in sog. sekundäre doppelsträngige RNA transkribiert. Diese wird von DICER-like-Enzymen (DCLs) in sekundäre siRNAs prozessiert, welche wiederum auf AGOs geladen werden. Dieser sich in 5'- und 3'-Richtung von der primären Zielregion ausbreitende Prozeß wird Transitivität oder transitive silencing genannt. Die mechanistischen Details der Transitivität sind weitgehend unbekannt. Die Größe und Struktur von siRNAs beeinflussen vermutlich die Einleitung der Transitivität. Es wird z.B. angenommen, dass ein mit einer 22 Nukleotid (22-nt) siRNAs beladene RISC die RDR6 rekrutiert. Vermutlich hat auch die Sequenz der Ziel-Transkripte einen Einfluß auf die Aktivierung der Transitivität. Neben Transitivität findet man in Pflanzen auch das sog. systemische Silencing. Über lange Distanzen wandernde silencing Signale können in Geweben produziert werden, in denen lokales silencing aktiviert wurde. In apikalen Blättern, die ein solches Signal aufgenommen haben, kann systemisches silencing, das das transitive silencing grundsätzlich einzuschließen scheint, von homologen Transkripten induziert werden. Es wurde bisher noch nicht gezeigt, ob systemisches silencing tatsächlich die Aktivierung von lokalem silencing erfordert. Eines unserer Ziele ist es daher zu untersuchen, ob das Einbringen eines vermeintlichen RNAi-Auslösers schon ausreicht, um systemisches silencing zu initiieren. Transkripte von Transgenen sind generell deutlich anfälliger für Transitivität und systemisches silencing, als die von Endogenen. Die Natur von RNAi-Auslösern und die Sequenz der Ziel-Transkripte scheinen die Aktivierung beider Prozesse zu beeinflussen. Wir wollen hier die Voraussetzungen für die Initiation von Transitivität und systemischen silencing für eine Auswahl von transgenen und endogenen Ziel-Transkripten mit Hilfe von synthetischen siRNAs als RNAi-Auslöser in Nicotiana benthamiana erforschen. Die Verwendung von synthetischen siRNAs erlaubt dabei erstmals die Beschaffenheit von RNAi-Auslösern genau zu studieren. Darüber hinaus sollen Transkripte, die sensitiv gegenüber der Produktion von sekundären siRNAs sind, z.B. solchen, die von intronlosen Transgenen abgeschrieben werden, mit denen verglichen werden, die nicht zur Produktion von sekundären siRNAs führen, z.B. solchen, die von intron-haltigen Transgenen und Endogenen generiert werden. Der hier beschriebene kombinatorische Versuchsaufbau in Verbindung mit den geplanten Analysen werden voraussichtlich wichtige neue Einblicke in den Mechanismus der Transitivität liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen