Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus Corrinoid-reduzierender Metallo-ATPasen

• Antragstellerin: Dr. Sandra Studenik
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 288495154

Im C1-Stoffwechsel von anaeroben Mikroorgansimen spielen proteingebundene Corrinoid-Cofaktoren eine wichtige Rolle. Um Methylgruppen zu binden, muss der Corrinoid-Cofaktor in der super-reduzierten [CoI]-Form vorliegen, die sehr anfällig gegenüber Autoxidation ist; als Folge kann es zur Bildung der inaktiven [CoII]-Form kommen. Daher wird eine "Reaktivierung" (i. e. Reduktion) benötigt, die im Allgemeinen durch Metallo-ATPasen katalysiert wird. Im Rahmen dieses Projektes soll hauptsächlich die ATP-abhängige Aktivierung von Protein-gebundenen Corrinoid-Cofaktoren der O-Demethylase-Systeme von Acetobacterium dehalogenans untersucht werden. In diesem Mikroorganismus wird die Corrinoidreduktion durch das Aktivierende Enzym (AE) in Anwesenheit von ATP und Titan(III)citrat als artifiziellem Elektronendonor katalysiert, indem das Mittelpunktpotential des [CoII]/[CoI]-Paares von < -550 mV auf ca. -320 mV angehoben wird. AE ist der COG3894-Proteinfamilie zugeordnet, hat eine Größe von ca. 65 kDa und besitzt einen [2Fe-2S]-Cluster. Der physiologische Elektronendonor der Aktivierungsreaktion sowie die enzymatische Reaktion, durch die dieser Elektronendonor reduziert wird, sollen identifiziert werden. Um weitere Informationen über den Reaktionsmechanismus der ATP-abhängigen Corrinoidreduktion zu erhalten, soll mittels Proteinkristallographie die Struktur des Proteinkomplexes bestehend aus AE und [CoII]-CP aufgeklärt werden. Mittels Redoxtitration gekoppelt an UV/Vis-Spektroskopie soll das Redoxpotential des Corrinoid-Cofaktors in An- und Abwesenheit von AE bzw. ATP bestimmt werden. Zusätzlich sollen drei weitere in A. dehalogenans identifizierte COG3894-Proteine hinsichtlich ihrer möglichen Fähigkeit zur Corrinoid-Reduktion untersucht werden. Dafür werden die entsprechenden Gene in Escherichia coli transformiert und die Genprodukte hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Funktion charakterisiert. Die Untersuchungen zur ATP-abhängigen Corrinoidreduktion sollen auf Desulfitobacterium hafniense ausgeweitet werden. Desulfitobakterien sind nicht-acetogene anaerobe Mikroorganismen, die hauptsächlich als reduktiv dehalogenierende Bakterien beschrieben sind. Sie besitzen ebenfalls O-Demethylase-Systeme, die die Verwertung methylierter Substrate ermöglichen. Die geplanten Untersuchungen sollen dazu beitragen, den Reaktionsmechanismus von thermodynamisch ungünstigen Elektronentransfer-Reaktionen, die durch die Hydrolyse von ATP angetrieben werden, aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen