Rapid Test for Antibiotic Resistances in Urological Sample Material by Surface Enhanced Raman Scattering SERS
Final Report Abstract
Die Anwendung der Raman-Spektroskopie in der Mikrobiologie hat aufgrund instrumenteller Fortschritte und verbesserter Möglichkeiten multivariater Datenauswertung, stark zugenommen. So ist die Verwendung von Raman-Mikroskopen zwar nichts Neues, leistungsstarke chemometrische Methoden und automatisierbare Messungen können aber erst seit Kurzem nützlich und zeiteffizient kombiniert werden. In dieser Arbeit wurde die Raman-Spektroskopie auf diese Weise in zwei unterschiedlichen Forschungsgebieten der Mikrobiologie eingesetzt. Die Entwicklung eines schnellen und zuverlässigen Antibiotika-Empfindlichkeitstest konnte vorangebracht werden. Da die Anzahl an resistenten Keimen zunimmt, wird es umso wichtiger, zuverlässige und zugleich schnelle Untersuchungsmethoden zu entwickeln. In dieser Arbeit wurde dazu die Raman-Spektroskopie im Zusammenspiel mit dem stabilen Isotop-Deuterium verwendet. In Form von schwerem Wasser (D2O) kann es Nährmedien zugegeben und dann von Bakterien aufgenommen werden. In den Raman- Spektren der Zellen kann anhand der neu entstehenden Bande der C-D-Streckschwingung zwischen 2100 und 2400 cm-1 der Einbau des Isotops in verschiedene Biomoleküle der Zellen und somit die Stoffwechselaktivität gemessen werden. In Vorversuchen wurden zwei Bakterienstämme (Gram-negative E-scherichia coli ATCC 9637 und Gram-positive Enterococcus faecalis ATCC 29212) untersucht. Als Voraussetzung für eine reproduzierbare und besonders schnelle Messung wurde die Probenvorbereitung optimiert. Ausgehend von der Bakterienkultur wurde die Zellmasse vor der Messung gereinigt, aufkonzentriert und getrocknet. Durch Wachstumsexperimente bei D2O-Konzentrationen von 0, 25 und 50% und Untersuchungen der Einwirkdauer verschiedener Antibiotika vor der D2O-Zugabe konnte ein allgemein anwendbares Protokoll erstellt werden, das die zuverlässige Unterscheidung in resistente und empfindliche Bakterien erlaubt. Dazu wurden die Bakterien bei einer definierten Antibiotika-Konzentration in Nährmedium, welches kein D2O enthält, 90 Minuten lang bei 37°C behandelt und bei ansonsten gleichbleibenden Bedingungen wurde die D2O-Konzentration auf 50% erhöht und nach einer weiteren Stunde die Probe genommen. Der Vergleich der Intensität der CD-Bande zu einer parallel durchgeführten Kontroll-Kultur liefert dann eine Aussage über die Empfindlichkeit des Bakteriums gegenüber dem Antibiotikum. Insgesamt dauert die Durchführung dieses Tests bis zum Ergebnis 3,5 Stunden. Im Vergleich dazu benötigt man für die Antibiotika Testung mittels herkömmlicher Tests, wie dem Epsilometer-Test, 16 – 24 Stunden. Die Anwendbarkeit des Protokolls wurde an 52 klinischen Isolaten (30 E. coli, 10 E. faecalis und 12 E. faecium) erprobt. Hier kam der große Vorteil des Protokolls gegenüber anderen bisher entwickelter Methoden bei sogenannten heteroresistenten Keimen zum Tragen. Dies sind genetisch identische Bakterien, bei denen ein gewisser Anteil an Zellen jedoch einen resistenten Phänotyp aufweist. Typische klinisch relevante Frequenzen resistenter Zellen liegen dann zwischen 10^-2 und 10^-7. Entsprechend bleibt dieses Phänomen jedoch je nach Testmethode unbemerkt und stellt somit eine der größten Gefahren für eine erfolgreiche Antibiotika-Behandlung dar. In dieser Arbeit konnten jedoch auch diese gefährlichen Isolate innerhalb von 5 – 6 Stunden erfolgreich als resistent erkannt werden. In einem Experiment wurden zudem heteroresistente Kulturen mit Frequenzen zwischen 10^-1 und 10^-4 modelliert und es konnte gezeigt werden, dass die Raman-Deuterium-basierte Testung eine Abschätzung der Frequenz ermöglicht. Ebenso wurde in einer Simulation aufgrund der experimentellen Ergebnisse gezeigt, dass Frequenzen bis zu 10^-7 innerhalb von 7 bis 8 Stunden detektiert werden können.
Publications
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Identifying Dormant Growth State of Mycobacteria by Orthogonal Analytical Approaches on a Single Cell and Ensemble Basis. Analytical Chemistry 2019, 91 (1), 881-887
Neumann, A. C.; Bauer, D.; Hoelscher, M.; Haisch, C.; Wieser, A.
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Deuterium uptake in combination with Raman spectroscopy as a tool to investigate antibiotic susceptibility of bacteria. SPIE BiOS 2020, 11223
Bauer, D.; Qiu, L.; Wieland, K.; Neumann-Cip, A.-C.; Wieser, A.; Magistro, G.; Stief, C.; Haisch, C.
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Heteroresistant Bacteria Detected by an Extended Raman-based Antibiotic Susceptibility Test. Analytical Chemistry 2020
Bauer, D.; Wieland, K.; Qiu, L.; Neumann-Cip, A.-C.; Magistro, G.; Stief, C. G.; Wieser, A.; Haisch, C.
