Analyse der PEN2-vermittelten Pathogeninvasionskontrolle in der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis
Final Report Abstract
Mit der Isolierung der Glykosidhydrolase PEN2 war eine molekulare Komponente der pflanzlichen Nichtwirtsresistenz identifiziert worden, die den Invasionserfolg nicht-adaptierter Pathogene ins Blattgewebe von Arabidopsis thaliana kontrolliert (Lipka et al., 2005). Transiente Doppelfluoreszenz-Markierungsexperimente hatten eine Assoziation von PEN2 mit Peroxisomen nahegelegt. Die ursprüngliche Arbeitshypothese war, dass das Peroxisomen-assoziierte PEN2-Protein vermutlich für die lokale enzymatische Freisetzung eines Sekundärmetabolits aus einer inaktiven Glykosidvorstufe verantwortlich ist. Um das biologische Wirkprinzip des PEN2-vermittelten Resistenzmechanismus besser zu verstehen, sollte im Rahmen des bewilligten Projekts eine umfassende und detaillierte Funktionsanalyse des PEN2-Proteins durchgeführt werden. Dazu sollte das pathogen-induzierte Zellpolaritätsphänomen, dem PEN2-assoziierte Peroxisomen unterliegen, zellbiologisch charakterisiert werden. Darüber hinaus sollten durch Kombination molekularbiologischer, biochemischer und genetischer Techniken strukturelle Funktionsdeterminanten des PEN2- Proteins, mögliche Protein-Interaktoren und weitere molekulare Komponenten der PEN2- vermittelten Resistenzmaschinerie identifiziert werden. Die im Rahmen des geförderten Projekts erzielten Ergebnisse zeigen, dass die an Orten versuchter Pathogeninvasion akkumulierenden und durch PEN2-GFP markierten subzellulären Kompartimente keinesfalls wie ursprünglich postuliert, reife Peroxisomen darstellen. Vielmehr legen unsere neuen Ergebnisse eine Pathogen-induzierte de novo-Bildung von funktional spezialisierten ER- Peroxisomen-Intermediat-Kompartimenten (sogenannte ERPICs) nahe. Diese unterliegen einer Pathogen-induzierten Zellpolarisation und weisen in ihrer Peripherie die Myrosinase PEN2 auf. Darüber hinaus zeigen unsere Analysen, dass das dynamische subzelluläre Lokalisationsverhalten von PEN2 durch seine einzigartige C-terminale Extension vermittelt wird und notwendig für die Funktionalität innerhalb der Nichtwirtsresistenz ist. Zusätzlich konnte innerhalb von konfokalmikroskopischen Zeitverlaufsexperimenten eine an ERPICs gebundene Aggregatbildung von PEN2 an Orten versuchter Pathogeninvasion visualisiert werden. Die Kapazität zur Homomerisierung konnten wir durch Split-Ubiquitin-Hefe-2- Hybridexperimente bestätigen. Proteininteraktoren außer PEN2 selbst konnten ansonsten nicht identifiziert werden. Der evolutiv junge Ursprung des PEN2-Gens und damit auch des PEN2-vermittelten Resistenzmechanismus konnte durch ausschließlichen Nachweis des Genprodukts in der Gattung Arabidopsis bestätigt werden. Die funktionale Diversifizierung innerhalb des PEN2-ähnlichen Genclusters scheint nicht in erster Linie durch zeitliche bzw. räumliche Expressions- und subzelluläre Lokalisationsmuster, sondern letztlich durch intrinsische Proteinmerkmale kontrolliert zu werden, welche (wahrscheinlich) Substratspezifität vermitteln. Das PEN2-nächst verwandte Gen At3g60120 scheint ebenfalls eine Rolle in der Invasionsresistenz gegenüber nicht-adaptierten Mehltau-Pilze zu spielen, da homozygote T-DNA-Insertionslinien dieses Gens erhöhte Penetrationsraten des Gerstemehltaus erlauben. Um die Substratspezifität von PEN2 und dem Genprodukt von At3g60120 weiter zu charakterisieren, sollen zukünftig vergleichende Sekundärmetabolitanalysen mit Blattextrakten entsprechender ko-Mutanten durchgeführt werden. Durch Analyse von Genen die einer transkriptionellen Co-Regulation mit dem PEN2- Gen unterliegen, konnte mit „embryo-abundant protein-related; methyltransferase domain protein„ At1g55450 mindestens eine weitere Komponente identifiziert werden, die das gleiche subzelluläre Lokalisationsverhalten wie PEN2 aufweist und ebenfalls an der Invasionskontrolle innerhalb der pflanzlichen Nichtwirtsresistenz beteiligt ist.
Publications
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(2008) Arabidopsis non-host resistance to powdery mildews, Current Opinion in Plant Biology 11: 404-411
Lipka, U., Fuchs, R., Lipka, V.
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(2009) Protein mislocalization in plant cells using a GFP-binding chromobody, Plant Journal 60: 744-754
Schornack, S., Fuchs, R., Huitema, E., Rothbauer, U., Lipka, V., Kamoun, S.
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(2010) Natural allelic variation underlying a major fitness trade-off in Arabidopsis thaliana, Nature 465, 632-636
Todesco, M., Balasubramanian, S., Hu, T.T., Traw M.B., Horton, M., Epple, P., Kuhns, C., Sureshkumar, S., Schwartz, C., Lanz, C., Laitinen, R.A.E., Huang, Y., Chory, J., Lipka, V., Borevitz, J.O., Dangl, J.L., Bergelson, J., Nordborg, M., Weigel, D.
