Synthese von Oligosaccharid(OS)-Polyetherbausteinen für den Aufbau von neuartigen ultradünnen biofunktionalisierten PEG-Stern-Polymerschichten
Final Report Abstract
Für den künstlichen Nachbau der natürlichen Präsentation verzweigter Zuckerketten auf N-Glykanen auf Hydrogeloberflächen wurde ein hoch variables Baukastensystem entwickelt. Diese Strategie erforderte drei Entwicklungs- und Arbeitsschritte. (i) Benötigt wurde die Synthese von Kopplermolekülen, die mit orthogonaler Chemie bis zu drei Bindungsstellen bereitstellen. Neuartige polydispere und monodisperse di- und trifunktionalen Koppler wurden dazu in diesem Projekt entwickelt. An deren Bindungsstellen können C1-funktionalisierte Zuckermoleküle regio- und stereospezifisch angekoppelt werden. (ii) Parallel wurden N-Acetyllactosamin-Oligosaccharide (Galβ1-4GlcNAcβ1-R, LacNAc; und [Galβ1-4GlcNAcβ]n1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R, poly-LacNAc) enzymatisch aus C1-funktionalisierten Starter-Monosacchariden hergestellt. In dieser Arbeit wurden poly-LacNAc Oligosaccharide mit bis zu 10 Zuckereinheiten enzymatisch synthetisiert. (iii) In Kombination wurden die Koppler und die Oligosaccharide anschließend auf Oberflächen verankert. Eine Verzweigung präsentierter Zucker kann durch die Multivalenz der trifunktionalen Koppler erreicht werden. Als Biomaterialoberfläche wurden modellhaft erstmals Hydrogele in der Mikrotiterplatte gewählt. In diesem Projekt wurde ein neues Konzept für die Immobilisierung von funktionalisierten Oligosacchariden bearbeitet. Die neu entwickelten di- und trifunktionalen Koppler tragen komplementäre funktionelle Gruppen zu den funktionalisierten Starter-Monosacchariden. So können je nach Immobilisierungsstrategie variabel aus dem Baukastensystem Koppler und Saccharide kombiniert werden. Insgesamt sechs azid-, acetylen- bzw. amino-funktionalisierte Monosaccharide konnten für das Kopplungssystem umfassend charakterisiert werden. Durch Kombination von drei rekombinanten Enzymen, die humane β4-Galaktosyltransferase (β4Gal-T), die bakterielle β3-N-Acetylglucosaminyltransferase (β3GlcNAcT) und diebakterielle UDP-Glucose 4-Epimerase, konnten poly-LacNAc Strukturen bis zum Decasaccharid (penta-LacNAc) ausgehend von den jeweiligen Starter-Monosacchariden synthetisiert werden. Eine Mutante (Y284L) der β4GalT wurde für die Synthese von neuartigen LacDiNAc-Strukturen verwendet. Optimierte Poly-LacNAc Synthesen im präparativen Maßstab erzielten Ausbeuten von >95%. Die synthetisierten Oligosaccharidbausteine wurden anschließend in Kombination mit den geeigneten Kopplern an verschiedenen Oberflächen immobilisiert. So wurde ein acetylenfunktionalisierter Koppler, der zusätzlich eine tBOC geschützte Aminofunktion trägt, mittels Klickreaktion nach Sharpless an azid-funktionalisierte Oligosaccharide gekoppelt und nach Entschützen an eine aminoreaktive Oberfläche immobilisiert. Alternativ wurde zuerst Propargylamin immobilisiert und anschließend die azid-funktionalisierte Oligosaccharide gekoppelt. Für dieses System kamen kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten und erstmals in sP(EO-stat-PO)-Hydrogelschichten in der Mikrotiterplatte (Kooperation mit Dr. J. Groll, DIW) zum Einsatz. Die Immobilisierung der Oligosacchariden bis zum Hexasaccharid wurde im Lektintest mit dem Pilzlektin CGL2 und mit humanem Galektin-1 funktionell verifiziert. Es ergaben sich qualitative Unterschiede zwischen kommerziellen Referenzoberflächen und Hydrogel-beschichteten Mikrotiterplatten. Unser System weist hohe Flexibilität und Funktionalität auf; dennoch müssen zukünftig die Beschichtungsprozesse der Hydrogele noch optimiert werden. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse eine solide Basis mit einem neuartigen, variablen Baukastensystem, um Oligosaccharide auf Oberflächen multivalent zu präsentieren und mit biologischen Bindungstests zu analysieren. Eine optimierte Beschichtung von Mikrotiterplatten mit Hydrogelen sollte die multivalente Präsentation von Zuckerstrukturen durch das Baukastensystem ermöglichen. Mit solchen multivalent Saccharid-funktionalisierten Hydrogelen könnten interaktive Biomaterialoberflächen erzeugt werden, die spezifisch und verstärkt Galectine und ECM-Glykoproteine binden, um die Adhäsion eines bestimmten Zelltyp an die Biomaterialoberfläche zu erzielen.
