Molekulare und strukturelle Muster parazellulärer Poren durch subtypabhängige Claudin-Claudin-Wechselwirkungen in Tight Junctions
Final Report Abstract
Struktur/Funktions-Studien der extrazellulären Loops (ECL) von Claudinen sollten zur Klärung parazellulärer Abdichtungsmechanismen beitragen. Durch Kombination von bioinformatischen, strukturellen und molekularbiologischen Untersuchungen sollten Determinanten identifiziert und Perspektiven für pharmakologische Interventionen eröffnet werden. Hierfür sollten unter gezielter Ausnutzung unterschiedlicher Porenbildungsfunktion und Sequenzunterschiede im ECL1 von Claudin-1 und -2 molekulare Muster parazellulärer Wechselwirkungen für Kanalbildung und Dichtheit identifiziert werden. In der ersten Förderperiode wurden Einzelmutationen analysiert. Diese Untersuchungen wurden in der zweiten Förderperiode insbesondere mittels Mehrfachmutation im ECL1 weitergeführt, um zusammenwirkende Aminosäure-Ensembles, welche die spezifische Porenfunktion von Claudin-2 bewirken, aufzudecken. Das Clostridium perfringens-Enterotoxin (CPE) stört die Tight Junction-Ausbildung von Claudin-3/-4. Unter Ausnutzung der vorliegenden CPE-Kristallstruktur sollte die komplette Bindungstasche im CPE kartiert werden. Durch gezielte Mutationen, sollten die selektiven Wechselwirkungsmuster von CPE für Claudin-3 herausgearbeitet und die unterschiedlichen molekularen Determinanten identifiziert werden, die eine Interaktion von CPE mit anderen Claudinen verhindern. Ziel war es, genau diese negativen Determinanten an CPE durch modellbasierte ortsgerichtete Mutation so zu verändern, um eine gezielte komplementäre Interaktion mit einem spezifischen Claudin-Subtyp (z.B. Cldn5 oder -1) zu generieren, mit dem CPEwt nicht interagiert. Modifiziertes CPE sollte zur (a) subtypspezifische Modulation der Claudine zwecks verbesserter Wirkstoffaufnahme oder (b) Therapie Claudin-überexprimierender Tumoren vorbereitet werden. Aminosäurereste, die zur Kanalfunktion der Claudine beitragen, wurden untersucht, indem Cldn1/Cldn2 Chimärmutanten in MDCK Zellen exprimiert wurden und deren Effekt auf den transepithelialen Wiederstand (TER) und die Ionenpermeabilität charakterisiert wurde. ECL1-Reste des abdichtenden Cldn1 wurden durch entsprechende Reste des kanalbildenden Cldn2 ersetzt. Hierüber wurden Hinweise erhalten, dass S53 und E48 in der Abdichtung des parazellulären Spalts beteiligt sind und dass die Bildung Ladungs-unabhängiger Poren durch die S53E-Substitution induziert werden könnte. Um die molekularen Grundlagen der Claudin-Assemblierung und der daraus resultierenden Barriere- oder Porenbildung zu verstehen, wurden Struktur-Funktionsstudien zu Cldn3 und -5 in enger Verbindung des TP6 und einem im DFG-Einzelverfahren geförderten Projekt durchgeführt. Der molekulare Mechanismus der Bindung des Clostridium perfringens-Enterotoxins (CPE) an Cldn3 und Cldn4 wurde aufgeklärt und genutzt, um CPE-Varianten mit veränderten Claudin-Bindungseigenschaften zu generieren. Der molekulare Mechanismus der differentiellen Bindung des Clostridium perfringens-Enterotoxins (CPE) an Cldn3 und Cldn4, nicht aber an Cldn1 und Cldn5, wurde aufgeklärt und genutzt, um eine CPE-Variante mit zu generieren, die hochaffin an Cldn5 bindet. cCPE-Varianten wurden erfolgreich eingesetzt, um BBB-TJs in vitro transient zu öffnen, die Hepatitis C-Infektion von Hepatozyten zu inhibieren und TJs während der Entwicklung des Hühnerembryos und des Zebrafisch-Embryos zu modulieren. Als weitere TJ-Modulatoren wurden Alkylglycerole getestet, beziehungsweise der Mechanismus der durch sie vermittelten transienten parazellulären Öffnung der Bluthirnschranke charakterisiert. Volllängen-CPE wurde verwendet, um Cldn3- und - 4-überexprimierende Tumorzellen in vitro und in vivo anzugreifen.
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