Identification of target-structures for gene suppression and post-translational changes in plant foods and their impact upon alteration of the allergenicity and immunogenicity in man

• Antragstellerin: Professorin Dr. Vera Mahler
• Fachliche Zuordnung: Dermatologie
• Förderung: Förderung von 2007 bis 2011
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 30717786

Basierend auf den Erkenntnissen der vorangegangenen Förderperiode wird der translationale Forschungsansatz im Rahmen des vorliegenden Paketantrags weiter vertieft.Die Hauptziele des Teilprojektes für die beantragte Förderperiode sind1.) Charakterisierung und Expression weiterer relevanter Tomatenallergene2.) In vivo-Untersuchung der Allergenität mutagenisierter Profilinvarianten3.) Präklinische und klinische Untersuchungen zum Nachweis der Hypoallergenität von Tomaten und Karotten, bei denen mittels RNAi zeitgleich mehrere Allergene ausgeschaltet wurden.Das erste Ziel umfasst die Charakterisierung und Aufreinigung der beiden Panallergene Polygalakturonase (PG) und Pectinesterase (PE), die Glykoproteine sind. Die cDNA-Klonierung erfolgt mittels PCR basierend auf den publizierten genomischen Sequenzen. Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgt in etablierten prokaryotischen und pflanzlichen Expressionssystemen. Der Einsatz von rekombinanten Allergenen und transgenem Pflanzenmaterial, dessen PG und PE mittels Haarnadel-RNA reduziert sind, ergänzt sich gegenseitig bei den Allergenitätsuntersuchungen.Für die zweite Fragestellung werden ausgewählte Profilinvarianten, die mittels eines Hefebasierten Screeningsystems identifiziert wurden, welches eine Selektion funktionaler mutagenisierter Profilinvarianten ermöglicht, bezüglich ihrer IgE-induzierenden Eigenschaften in vivo in einem Mausmodell eingesetzt.Zusätzlich zur Immunoblotuntersuchung der IgE-Bindung im rekrutierten Kollektiv der Tomatenallergiker werden die Lyc e 1-Varianten von der Antragstellerin für den Einsatz im Hauttest exprimiert und in vivo bei geeigneten Probanden getestet. Zusätzlich wird die T-Zell-Reaktivität nach Stimulation mit hypoallergenen Lyc e 1-Varianten in T-Zelllinien und -Klonen von Profilin-allergischen Patienten untersucht.Als drittes Ziel wird der grundsätzliche Nachweis einer ausreichenden Allergenreduktion in Pflanzen, bei denen gleichzeitig mehrere Allergene mittels RNAi reduziert wurden, und ihr Benefit für Tomaten- und Karottenallergiker angestrebt. Hierfür sind zunächst IgEImmunoblotuntersuchungen und Pricktestung mit den generierten Tomatenfrüchten und Karotten beabsichtigt. Diese stellen Surrogatmarker der Allergenität dar. Daher ist anschließend ein titrierter oraler Provokationstest als Goldstandard mit Gen-modifizierten Tomaten (ohne Kerne) im Vergleich mit Wildtyp-Tomaten beabsichtigt. Eine positive Stellungnahme seitens des Bundesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit und dem Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, sowie Einwilligung von freiwilligen Studienteilnehmern liegen diesbezüglich bereits vor.Zusätzlich ist die Schwellenwertbestimmung von Allergendosen, die ohne objektivierbare Symptome (NOAEL) von Karotten-allergischen Patienten toleriert werden, und niedrigste Symptomauslösende Dosis (LOAEL) in einer doppel-blinden plazebo-kontrollierten titrierten Provokationstestung (DBPCFC) mit Wildtyp-Karotten parallel zur Bestimmung der verabreichten Allergendosis auf Einzelallergenniveau geplant.Weiterhin werden wir die bestehenden Patientenkohorten aufrechterhalten und erweitern, sowie geeignete Freiwillige für die Untersuchungen aller Teilprojekte des Paketantragesgewährleisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen