Molekulare Determinanten der zytosolischen Insertion von Eisen-Schwefel-Clustern

• Antragsteller: Professor Dr. Antonio J. Pierik
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 311771359

In den letzten Jahren konnte ein signifikanter Anstieg des Verständnisses der zytosolischen und nuklearen Eisenschwefel (FeS)-Proteinreifung erreicht werden. Für die meisten eukaryotischen FeS-Zielproteine wurden jedoch nur wenige oder keine mechanistischen Details für die Cluster-Insertion beschrieben. Im Gegensatz zu mitochondrialen FeS-Proteinen weisen 20 % der Hefe und 14 % der humanen zytosolischen und nuklearen FeS-Proteine einen Tryptophanrest an ihrem C-Terminus auf, der häufig im L(D/E)W-Tripeptid vorkommt. Unsere in vivo Daten in Saccharomyces cerevisiae (Hefe) und in vitro Ergebnisse innerhalb der ersten Förderperiode zeigten, dass die FeS-Cluster-Insertion durch die CIA-Maschine, die Funktion der CIA-Komponente Nar1, die Isopropylmalat-Isomerase Leu1 und die DNA-Polymerase Pol3 entscheidend vom Tryptophanrest an ihrem C-Terminus abhängen. Für Pol3 war der Tryptophanrest nur unter DNA-beschädigenden Bedingungen kritisch, was darauf hindeutet, dass der [4Fe-4S]-Cluster möglicherweise nicht in erster Linie mit der DNA-Replikation, sondern mit der Reparatur zusammenhängt. Leu1 diente als hervorragendes Modell, um Verlust und Funktionsgewinn zu testen. Unter Verwendung von Varianten der Hefe Leu1 und der modifizierten E. coli Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD), die mit Hefe Leu1 C-terminalen Determinanten fusioniert sind, konnten wir zeigen, dass nicht nur der Tryptophanrest, sondern auch eine optimale Länge der Verlängerung und die Zugänglichkeit des letzten Restes kritische Determinanten sind. In weiteren Experimenten wird die Universalität unseres Systems mit C-terminalen Determinanten von phylogenetisch unterschiedlichen Leu1-Proteinen und C-termini von anderen zytosolischen Fe/S-Proteinen (Nar1, Pol3, Viperin), die mit dem Leu1/LeuCD-System in Hefe fusioniert sind, getestet. Wir werden neue molekulare Toolboxen als Alternative für die bisher auf radioaktivem Eisen basierende Reifungsanalyse entwickeln. Dazu zählen selektive EPR-Spektroskopie in vivo und an Zellextrakt-Clustertypen sowie die Verwendung stabiler Eisenisotope für ICP-MS nach Pulldown. Unsere vorläufigen Daten zeigen, dass sehr intensive und spezifische EPR-Signale für Apd1, ein intrinsisches zytosolisches Bis-Histidinyl koordiniertes [2Fe-2S]-Protein sowie andere [2Fe-2S]-Proteine aus Pilzen und mehrere FeS-Dehydratasen in Hefezellextrakt quantifiziert werden können. Mit diesen Ansätzen wollen wir die CIA-Maschinerie auf molekularer Ebene in [2Fe-2S] und [4Fe-4S] spezifische Segmente zerlegen. Mit den relativ thermo- und O2-stabilen 6-Phosphogluconat- und Dihydroxysäure-Dehydratase-Enzymen werden wir den Einsatz der C-terminalen Erweiterung für biotechnologische Anwendungen von nicht-Hefe, FeS-Cluster-haltigen Enzymen untersuchen. Unsere Arbeiten zielen auch darauf ab, letztendlich eine aktive FeFe Hydrogenase im Hefezytosol zu entwickeln.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life