Identifizierung des RNA-Protein-Netzwerkes in Makrophagen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Antje Ostareck-Lederer
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 313418556

Die Interaktion von Zellwand-Lipopolysacchariden (LPS) Gram-negativer Bakterien mit dem TLR-4 Rezeptor von Makrophagen führt über verschiedene Signalwege zur Aktivierung von Kinasen (MAPK) und Transkriptionsfaktoren (NFkappaB), die die Transkription pro- and anti-inflammatorischer Zytokigene aktivieren. Obwohl diese Mediatoren wichtig für die zelluläre Infektionsantwort sind, führt die exzessive Produktion pro-inflammatorischer Cytokine zur systemischen Inflammation und Sepsis. Nach Herz-Kreislauferkrankungen und Krebs, ist Sepsis weltweit die dritthäufigste Todesursache. RNA-bindende Proteine (RBP) sind an der post-transkriptionalen Regulation der LPS-vermittelten Makrophagen-Aktivierung beteiligt. Wir charakterisierten in unbehandelten und LPS-aktivierten RAW 264.7 Makrophagen differentielle mRNA-RNP (mRNP) Interaktionen, die potentiell die Proteinsynthese regulieren. Dazu wurden mRNP Interaktionen durch UV-Vernetzung stabilisiert, nach Zelllyse erfolgte die Reinigung polyadenylierter RNAs über eine oligo(dT) Matrix und RNA-gebundene Proteine wurden massenspektroskopisch analysiert. 402 RBPs wurden identifiziert, für 91 dieser Proteine ist bisher keine Funktion im Zusammenhang mit RNA oder Nukleinsäuren beschrieben. Der Vergleich mit den publizierten mRNA-Interaktomen klassifizierte 32 als neue, Makrophagen-spezifische RBPs. Von diesen sind 19 Proteine noch nicht im Zusammenhang mit RNA annotiert. Aus dieser Gruppe wurden das HSP90 co-chaperone P23, für welches auch cytosolische Prostaglandin E2 Synthase 3 (PTGES3) Aktivität beschrieben ist, und das hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1 (HCLS1 oder HS1), ein spezifisches Adaptormolekül hämatopoietischer Zellen ausgewählt, und ihre Bindung an poly(A)RNA in vitro validiert. Die Immunopräzipitation neu identifizierter RBPs durch spezifische Vernetzungsmethoden (crosslinking and immunoprecipitation, CLIP) soll mit der Identifizierung (high throughput next generations equencing, HTNGS) der durch die isolierten RBPs gebundenen mRNAs kombiniert werden. Es können sowohl spezifische RNP-Bindungsmotive in Ziel-mRNAs identifiziert, als auch die differentielle Bindung von RNAs in Abhängigkeit von Makrophagen-Aktivierung durch LPS untersucht werden. Im Rahmen des Schwerpunktprogramms SPP 1935, werden durch das Projekt wesentliche neue Informationen über Säugetier RBP-Repertoire gewonnen und es werden neue Makrophagen mRNPs identifiziert und funktional charakterisiert, die für die Regulation und Aktivität LPS-induzierter Signalwege von Bedeutung sind. Neue Erkenntnisse über die RBP-vermittelte Regulation der Genexpression im Kontext der Makrophagen-Aktivität eröffnen eine Perspektive zur Entwicklung spezifischer therapeutischer Strategien zur Behandlung der systemische Inflammation und Sepsis.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1935: Deciphering the mRNP code: RNA-bound determinants of post-transcriptional gene regulation