Charakterisierung der molekularen Eigenschaften des pestiviralen Erns Proteins im Kontext mit seiner Funktion als Strukturkomponente und Virulenzfaktor
Immunologie
Virologie
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Pestiviren stellen wichtige Krankheitserreger von landwirtschaftlichen Nutztieren dar und sind zudem von wissenschaftlichem Interesse, weil sie besondere Strategien entwickelt haben, deren Erforschung unser Wissen über Virus/Wirtsbeziehungen entscheidend erweitert hat. Eine auffällige Eigenschaft von Pestiviren ist ihre Fähigkeit, durch Verhinderung der Immunantwort des Wirtes lang anhaltende persistierende Infektionen zu etablieren. Dies wird u.a. durch zwei virale Proteine, Npro und Erns, erreicht, die auf unterschiedlichen Ebenen die angeborene Immunantwort des Wirtes reprimieren. Erns ist ein Strukturprotein der Pestiviren, das aber zusätzlich als Virulenzfaktor und unterstützende Komponente bei der Persistenz fungiert. Erns wird von infizierten Zellen sekretiert und zirkuliert im infizierten Tier unabhängig vom Virus, was zu der Hypothese geführt hat, dass das sekretierte Protein den eigentlichen Virulenzfaktor darstellt. Es wird aber nur ein geringer Anteil des in der Zelle synthetisierten Erns sekretiert, da das Protein intrazellulär benötigt wird, um infektiöse Pestiviruspartikel zu bilden. Deshalb muss der überwiegende Teil des nach Infektion synthetisierten Proteins in der Zelle zurückgehalten werden. Den Schlüssel zum Verständnis dieser widersprüchlichen Eigenschaften stellt nach unseren Ergebnissen der ungewöhnliche Membrananker des Proteins dar. Erns ist eines von zwei (viralen) Oberflächenproteinen, die über eine lange, parallel zur Membranoberfläche ausgerichtete amphipathische Helix an die Membran gebunden sind. Trotz dieser ungewöhnlichen Topologie wird der Carboxyterminus des Erns durch die zelluläre Signalpeptidase generiert. Die Spaltung ist abhängig von der Integrität der amphipathischen Helix und der im Polyprotein nachfolgenden Sequenz des Strukturglykoproteins E1. Trunkierungen des E1 führten zu drastisch reduzierter Spaltung und stark gesteigerter Sekretion des Erns-E1 Vorläufers. Neben der Integrität des E1 ist zudem eine Prozessierung an der E1/E2 Spaltstelle wichtig für die Erns-E1 Spaltung. Somit folgt die Prozessierung des Glykoproteinvorläufers einer hierarchischen Ordnung, wodurch eine sichere Membranverankerung von Erns-E1 durch den E1 Membrananker sichergestellt wird, die Zeit für den Aufbau der Membraninteraktion des Erns Carboxyterminus und die anschließende Spaltung des Vorläufers bereitstellt. Die geordnete Reihenfolge der Spaltungen könnte zudem einen ‚Co-chaperon‘ Effekt haben, mit dem eine koordinierte Faltung der Proteine und Maskierung des bisher unbekannten Fusionspeptides der Pestiviren erreicht werden kann. Der Erns Membrananker enthält auffällige konservierte Sequenzmotive. Dazu gehört eine Reihe geladener Aminosäuren mit reziproker Verteilung der Ladungen auf beiden Seiten einer Symmetrieachse, die eine Rückfaltung in eine mittels Salzbrücken stabilisierte Haarnadelschleife, einen sogn. „charge zipper“, ermöglichen würde, die für die Erns-E1 Spaltung und die Erns Membranverankerung wichtig sein könnte. Einflüsse dieser geladenen Reste auf Prozessierung und Membranverankerung sowie intrazelluläre Retention des Erns konnten durch Mutationsanalysen gezeigt werden, aber Beweise für einen ‚charge zipper‘ konnten wir nicht erhalten. Um Hinweise auf die Gründe für die Konservierung von geladenen Resten, die keine offensichtliche Funktion für Prozessierung oder Membranbindung haben, zu erhalten, wurden Pestivirusmutanten mit entsprechenden Austauschen analysiert, wobei einige Austausche stabil erhalten blieben, andere umgehend revertierten. Ein Teil der Veränderungen verhinderte die Bildung infektiöser Viren und wurde weiter analysiert, um Hinweise auf zugrunde liegende funktionelle Defekte zu erhalten. Dabei zeigte sich, dass diese Mutationen die Bildung und/oder Ausschleusung von Viruspartikeln verhinderten, was mit einer (elektronen)mikroskopisch nachgewiesenen veränderten Lokalisation in der Zelle zusammenhängen könnte. Im letzten Stadium der Arbeiten haben wir noch interessante Hinweise darauf erhalten, dass für die Bildung und Ausschleusung infektiöser Pestiviruspartikel nicht das ganze Erns erforderlich ist, sondern der Carboxyterminus mit der amphipathischen Helix ausreicht. Dieses Ergebnis korreliert mit Studien, die zeigten, dass die Einlagerung solcher Strukturen in Membranen deren Krümmung verursachen, und passt zudem zur Tatsache, dass bei pseudotypisierten Viren E1 und E2 alleine die Infektion von Zellen bewirken können. Unsere Arbeiten haben damit entscheidende Fortschritte für das Verständnis der Molekularbiologie des faszinierenden Erns Proteins und seines Membranankers gebracht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- 2016. Type I and III IFNs produced by plasmacytoid dendritic cells in response to a member of the flaviviridae suppress cellular immune responses.J. Immunol. 196:4214-4226
Reid, E, Juleff, N., Windsor, M, Gubbins, S, Roberts, L, Morgan, S, Meyers, G, Perez-Martin, E, Tchilian, E, Charleston, B, Seago, J
(Siehe online unter https://doi.org/10.4049/jimmunol.1600049) - 2017. Self-Replicating RNA. Methods Mol. Biol. 499:15-35
Tews. B.A., and Meyers, G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6481-9_2) - 2017. Type 2 BVDV Npro suppresses IFN-1 pathway signaling in bovine cells and augments BRSV replication. Virology. 507:123-134
Alkheraif AA, Topliff CL, Reddy J, Massilamany C, Donis RO, Meyers G, Eskridge KM, Kelling CL
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.virol.2017.04.015) - 2018. Restoration of glycoprotein Erns dimerization via pseudoreversion partially restores virulence of classical swine fever virus. J Gen Virol. 99:86-96
Tucakov AK, Yavuz S, Schürmann EM, Mischler M, Klingebeil A, and Meyers G
(Siehe online unter https://doi.org/10.1099/jgv.0.000990) - 2021. Downstream sequences control the processing of the pestivirus Erns-E1 precursor. J Virol 95:e01905-20
Mu Y, Bintintan I, Meyers G
(Siehe online unter https://doi.org/10.1128/JVI.01905-20)
