Transientenkinetische Analyse des Nukleotid-Selektionsmechanismus von DNA-Polymerasen mit Hilfe sterischer Sonden

• Applicant: Professor Dr. Tobias Restle
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 2006 to 2010
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 31435328

Das vorgeschlagene Projekt soll weitergehende Erkenntnisse hinsichtlich molekularer Mechanismen der intrinsischen Substratspezifität von DNA-Polymerasen liefern. Hierzu sollen vergleichende Untersuchungen transientenkinetischer Parameter des Nukleotideinbaus verschiedener DNA-Polymerasen und entsprechender Mutanten aus unterschiedlichen Organismen und Polymerasefamilien durchgeführt werden. Von besonderem Interesse ist hierbei der Einsatz modifizierter Nukleotide als sterische Sonden. Im Gegensatz zu beschriebenen Modifikationen, die üblicherweise an der Base lokalisiert sind, sollen hier Modifikation an der 4´Position des Zuckers verwendet werden. Durch Variation der Länge von bestimmten Alkylsubstituenten kann dabei der Platzbedarf des Nukleotids in der Bindungstasche einer Polymerase sukzessive erhöht werden, und somit wichtige Erkenntnisse betreffend einer möglichen Korrelation geometrischer Parameter und der Substratspezifität, sowie der Rolle des Zuckers bei der Nukleotidselektion, gewonnen werden. Entsprechende Voruntersuchungen zeigen nachhaltig die Zweckmäßigkeit dieses Ansatzes, wie durch entsprechende Publikationen belegt. Auf diesen Erkenntnissen aufbauende Studien, lassen weitergehende Einsichten hinsichtlich molekularer Mechanismen der variierenden Substratselektivität von DNA-Polymerasen erwarten.

• DFG Programme: Research Grants
• Major Instrumentation: Stopped Flow Apparatur
• Instrumentation Group: 1850 Spektralfluorometer, Lumineszenz-Spektrometer (außer Filterfluorometer