Regulation der miRNA-Biogenese in Arabidopsis - RNA-Affinitätsaufreinigung zur Charakterisierung von pri-miRNA Bindeproteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Regulation durch RNA-bindende Proteine (RBPs) und miRNAs ist der Schlüssel zur Koordination der eukaryotischen Genexpression. Bei Pflanzen wird die Bedeutung der miR- NAs durch schwere Entwicklungsdefekte in Mutanten, die in der miRNA-Biogenese gestört sind, hervorgehoben. MiRNAs werden aus langen pri-miRNAs mit internen Haarnadelstrukturen durch endonukleolytische Spaltung generiert. Die hochstrukturierten Haarnadelstrukturen bilden die Grundlage für die umfassende Regulation der miRNA-Biogenese durch Interaktion mit RBPs. Allerdings sind trans-wirkende Regulatoren der Biogenese spezifischer miRNAs in Pflanzen weitgehend unbekannt. Daher haben wir RNA-zentrierte Ansätze entwickelt, um Interaktoren ausgewählter pri-miRNAs in vitro zu identifizieren. Zunächst nutzten wir einen RNA-zentrierten Ansatz, der auf modifizierten Versionen der CRISPR-Nuklease Csy4* basiert. Um die mit dem Csy4*-System verbundenen technischen Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir zusätzlich eine leistungsfähige RNA-Affinitätsreinigungsstrategie auf Streptavidin-Basis entwickelt. Die Protein-Interaktoren der pri-miRNAs wurden mittels quantitativer Massenspektrometrie identifiziert. Insgesamt identifizierten wir hunderte Interaktoren mit einer möglichen regulatorischen Funktion in der miRNA-Biogenese. Zum Nachweis ihrer physiologischen Relevanz in der miRNA-Biogenese wurden loss- und gain-of-function Mutanten ausgewählter RBPs genotypisiert und analysiert. Unter anderem konnten wir zeigen, dass Mitglieder der Glycin-reichen, Serin-Arginin (SR)-reichen und RNA-Helikase Familie die Biogenese spezifischer miRNAs regulieren. Um genomweite Einblicke in das Ausmaß und den molekularen Mechanismus der RBP-Wirkung zu erhalten, identifizierten wir direkte in vivo targets und Bindungsstellen des RS-Proteins RS31 durch plant individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation (plant iCLIP). Insgesamt liefert das Projekt neue Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen, die der posttranskriptionellen Regulation der miRNA-Biogenese durch pflanzliche RBPs zugrunde liegen und trägt zum Verständnis der regulatorischen Prinzipien der eukaryotischen miRNA-Expression bei.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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“Genome-wide determination of RNA-binding protein targets in Arabidopsis“ Invited speaker at IGC symposium 2017 “Plant RNA biology”, Oieras, Portugal (2017)
Tino Köster
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Plant Ribonomics: Proteins in Search of RNA Partners. Trends in Plant Science, 23(4), 352-365.
Köster Tino & Meyer Katja
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Systems Approaches to Map In Vivo RNA–Protein Interactions in Arabidopsis thaliana. RNA Technologies, 77-95. Springer International Publishing.
Lewinski, Martin & Köster, Tino
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CLIP and RNA interactome studies to unravel genome-wide RNA-protein interactions in vivo in Arabidopsis thaliana. Methods, 178, 63-71.
Köster, Tino; Reichel, Marlene & Staiger, Dorothee
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CLIP and complementary methods. Nature Reviews Methods Primers, 1(1).
Hafner, Markus; Katsantoni, Maria; Köster, Tino; Marks, James; Mukherjee, Joyita; Staiger, Dorothee; Ule, Jernej & Zavolan, Mihaela
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“Profiling a new set of nucleoplasmic players in miRNA biogenesis” DBG hot topic meeting “It’s in your RNA”, Bielefeld, Germany (2021)
Tino Köster
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Identification of Pri-miRNA Stem-Loop Interacting Proteins in Plants Using a Modified Version of the Csy4 CRISPR Endonuclease. International Journal of Molecular Sciences, 23(16), 8961.
Lüders, Janina; Winkel, Andreas R.; Reichel, Marlene; Bitterer, Valentin W.; Scheibe, Marion; Widmann, Christiane; Butter, Falk & Köster, Tino
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Plant iCLIP — auf Spurensuche im Transkriptom der Pflanze. BIOspektrum, 29(2), 174-176.
Köster, Tino & Sitte, Astrid
