Development of a dual screening assay for the efficient search for antiviral Hepatitis C entryinhibitors from microorganisms
Analytical Chemistry
Final Report Abstract
Der Pool an Naturstoffen eignet sich für die Suche nach neuen Arzneistoffen und neuen Leitstrukturen nach wie vor hervorragend. Der Arbeitskreis von Prof. Loesgen hat es sich zum Ziel gesetzt, aus ihrer Bibliothek an endophytische Pilzen und terrestrischen Bakterien aus wenig erforschten Quellen aus Oregon und Europa aktivitätsgeleitet neue Naturstoffe zu isolieren und in verschiedenen Assays auf biologische Aktivität zu testen. In diesem Kontext sollte im Rahmen meines Forschungsvorhabens ein dualer Screening Ansatz auf HCV-Entryinhibitoren entwickelt werden, der ein schnelles und effizientes Screening der Extrakte ermöglichen sollte. Ein robuster HCV-Pseudovirus-Assay konnte im Zeitrahmen der Förderung jedoch nicht abschließend entwickelt werden, da es zu Verzögerung kam, um die benötigten Zelllinien und Plasmide von Industrie und akademischen Partnern zu bekommen. In der kurzen Zeit, in der all Reagenzien zur Verfügung standen, konnten keine infektiösen Partikel produziert werden. Optimierungsprozesse werden im Rahmen eines Graduate Student Programmes im Arbeitskreis weitergeführt. Neben Testung auf antivirale Aktivität werden im Arbeitskreis von Prof. Loesgen die Extrakte, Fraktionen und isolierte Verbindungen auf zytostatische Aktivität gescreent. Dieses führte zur Wiederentdeckung des Naturstoffes Mensacarcin. Mensacarcin ist ein hochkomplexes Polyketid und wird von einem Erdbakterium produziert. Das initiierte NCI-60 Screening weist auf eine generalisierte hochpotente zytostatische Aktivität hin, wohingegen Zytotoxizät vornehmlich zellspezifisch in Melanomazellen ausgelöst wird. Ich konzentrierte meine Arbeiten auf die detaillierte Evaluierung der Aktivität dieses vielversprechenden neuen Naturstoffes. Anfängliche Annahmen, dass es sich bei Mensacarcin um eine DNA-agierende Verbindung handelt, konnte im Rahmen der Arbeit in etlichen Studien widerlegt werden. Detaillierte Studien zu Mensacarcins zytotoxischen Effekten in Melanoma wurden mittels verschiedener Zellproliferationstests, Fluoreszenzmikroskopie, und FACS unternommen. Die chemische Synthese einer Rhodamin-Mensacarcin Sonde half den Wirkungsort von Mensacarcin in den Mitochondrien zu identifizieren. Messung des metabolischen Umsatzes in Melanomazellen bestätigt, dass Mensacarcin deren Energieumsatz beeinflusst. Die inzwischen im Journal of Biological Chemistry publizierten Ergebnisse zeigen, dass Mensacarcin einen schnellen und einzigartigen Effekt auf den Energiemetabolismus von Melanomazellen besitzt. Als vielversprechende neue Verbindung ist Mensacarcin eine wichtige und neue potentielle Leitstruktur für die Melanoma- Therapie. Meine in-vitro Ergebnisse zu Mensacarcins mode of action werden nun vom Arbeitskreis Loesgen/Indra in einem Xenograph Mausmodel getestet. Chemische Derivate des Mensacarcins, duale Dosierung mit der klinisch eingesetzten Anti-Melanoma Verbindung Vemurafenib, sowie Protein Expressionsanalyse von behandelten Melanomazellen sind vielversprechende Ansätze, die durch meine Arbeiten ermöglicht wurden. Die ausgezeichnete Infrastruktur der Oregon State University erlaubte mir Instrumente wie FACS, konfokaler Mikroskopie, oder Seahorse zu nutzen. Zudem konnte ich viele Aspekte der Naturstoff Chemie lernen: Von der Mikrobiologie der Bakterien und Pilzen, chemische Analyse von Extrakten, chemische Synthese, Aufreinigung mittels Chromatographie, und Struktur Aufklärung mittels Massenspektrometrie und NMR. Meine Arbeiten zu Mensacarcin werden von der Doktorandin Elizabeth Kaweesa weitergeführt. Arbeiten zur DNA Binding werden auch weitergeführt und erste Resultate von Doktorand Ross Overacker sind vielversprechend und zeigen DNA-bindende Naturstoffe sogar in Rohextrakten.
Publications
- The Natural Product Mensacarcin Induces Mitochondrial Toxicity and Apoptosis in Melanoma Cells. J. Biol. Chem. Oct 26, 2017
Plitzko B., Kaweesa, E. and Loesgen S
(See online at https://doi.org/10.1074/jbc.M116.774836)
