Functional genetic correction of the X-linked Severe Combined Immunodeficiency using engineered nucleases (TALENs or CRISPR/Cas)
Final Report Abstract
Wir entwickeln hier einen universellen Gen-Korrektur Ansatz der nahezu allen Patienten mit X-chromosomal vererbtem, schweren kombinierten Immundefekt (SCID) einen Therapieansatz bietet. Die Erkrankung wird durch Mutationen im IL2RG-Gen hervorgerufen und führt zu einer schweren Immundefizienz, die unbehandelt zum Tode führt. Aktuell ist die Standard-Therapie der Austausch des hämatopoietischen Systems durch allogene Stammzelltransplantation. Diese ist in vielen Fällen sehr erfolgreich, aber kann eingeschränkte Ergebnisse erzielen wenn die Patienten erst spät erkannt werden oder wenn kein passender Stammzellspender zur Verfügung steht. Gentherapie hat gezeigt, dass das Einbringen einer korrekten Version des Gens in hämatopoietische Stammzellen die Erkrankung heilen kann, ist jedoch mit dem Risiko der Genotoxizität assoziiert, da die viralen Vektoren sich zufällig in das Genom integrieren. Wir entwickeln hier einen Ansatz um die Erkrankung in Patienten-eigenen (autologen) hämatopoietischen Stammzellen zu korrigieren, indem Methoden zur Genom-Editierung verwendet werden um das Gen gezielt zu korrigieren. Da die Mutationen, die die Erkrankung hervorrufen, über das gesamte Gen verstreut auftauchen können, ist es nur schwer möglich eine gezielte Korrektur jeder spezifischen Mutation durchzuführen. Daher verwenden wir den Ansatz, eine korrekte Version der kodierenden Abschnitte des Gens (cDNA) in den endogenen Gen-Lokus gezielt einzubringen. Somit wird die mutierte Version des Gens durch eine korrekte Version ersetzt. Dies kann mit der Endonuklease CRISPR/Cas9 und rekombinantem adenoassoziierten Virus vom Serotyp 6 (rAAV6) sehr erfolgreich durchgeführt werden. Cas9 erzeugt einen DNA-Doppelstrangbruch in der kodierenden Region des IL2RG-Gens. Die Zelle versucht daraufhin, den Strangbruch zu reparieren. Ein möglicher Mechanismus dafür ist homologe Rekombination, in dem die Zelle homologe Regionen verwendet um den Strangbruch durch „Copy and paste“ zu reparieren. Wenn eine Vorlage dafür mittels rAAV6 in die Zelle transduziert wird, kann eine gewünschte Veranederung in der DNA hervorgerufen werden, z.B. das Einfügen der korrekten Version des IL2RG-Gens in den IL2RG-Genlokus. Wir zeigen hier, dass dies in hämatopoietischen Stammzellen möglich ist und diese ihre Funktion behalten und die Linien des Blut- und Immunsystems hervorbringen können. Es ist nun geplant, diesen Ansatz in einer klinischen Studie an Patienten zu testen.
