Strukturveränderung und Inaktivierung von Enzymen während der Trocknung und Partikelbildung aus levitierten Mikrotröpfchen
Pharmazie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hauptziel des Forschungsprojektes war die Untersuchung von Strukturveränderungen von Enzymen während der Trocknung und Partikelbildung aus Einzeltröpfchen in einem akustischen Levitator. In einem solchen Levitator können Veränderungen, wie sie u.a. in pharmazeutischen Industrieprozessen wie der Sprühtrocknung relevant sind, unter wohldefinierten Bedingungen in situ erfasst werden. Die mittels optischer Messverfahren erfassten Daten wurden in Korrelation gesetzt zur ex situ bestimmten Aktivität von Proben, die während des Trocknungsvorgans aus dem Levitator entnommen wurden. Die experimentellen Untersuchungen wurden begleitet von numerischen Untersuchungen, in denen ein Modell zur Beschreibung des gekoppelten zeitabhängigen Problems bestehend aus Strömungsmechanik, Wärmetransport/Diffusion, Trocknung und Partikelbildung aus einem Einzeltröpfchen einer Proteinlösung aufgestellt wurde. Ein kommerzieller akustischer Levitator wurde mit einer temperierbaren Levitatorkammer zur Durchführung von Trocknungsexperimenten unter definierten Bedingungen sowie mit Messeinrichtungen (Raman-, Fluoreszenz-, Absorptionsspektroskopie, Schattenaufnahme) zur Untersuchung von Strukturveränderungen und des Trocknungsvorganges ausgestattet. Zusätzlich wurde durch Entnahme der Tröpfchen/Partikel aus dem Levitator die Inaktivierung mittels Bioassay bzw. der Aggregationszustand in Abhängigkeit von der Zeit ermittelt und der Einfluss von Hilfsstoffen (Kohlenhydraten, Aminosäuren) auf die Aktivität von Proteinen untersucht. Die Untersuchungen des Aggregationsverhaltens während der Einzeltropfentrocknung haben ergeben, dass der kritische Punkt der Trocknung („Krustenbildung“) mit der Bildung von unlöslichen Aggregaten korreliert, vermutlich durch den raschen Temperaturanstieg am kritischen Punkt ohne kühlende Wirkung des verdampfenden Lösungsmittels. Die Aktivitätsbestimmungen ergaben eine Korrelation mit der Trocknungslufttemperatur. Je höher die Trocknungslufttemperatur, desto kürzer war die Erhaltung der Anfangsaktivität und desto höher der Grad der daraufhin eintretenden Inaktivierung, wobei die maximale Inaktivierungsrate kurz nach dem kritischen Punkt auftrat. Bei den Untersuchungen des Aggregations- und Inaktivierungsverhaltens ergaben Vergleichsmessungen in Küvettenexperimenten, dass neben der rein thermisch verursachten Agglomeration und Inaktivierung weitere agglomerierenden und inaktivierende Effekte auf die Proteinstruktur wirken. Die Zugabe von Trehalose und Arginin als Hilfsstoffe während der Trocknung zeigte einen stabilisierenden Effekt. Die spektroskopischen Untersuchungen ergaben, dass die sekundären Strukturveränderungen in allen Strukturanteilen auftreten und mit zunehmender Trocknungstemperatur schneller und auch stärker ausgeprägt sind. Die Korrelation der Strukturveränderungen mit den Ergebnissen der Absorptionsspektroskopie ergab zudem, dass die Veränderungen vor allem um den kritischen Punkt der Trocknung zu beobachten waren. Die numerische Betrachtung ergab, dass der Levitationsprozess einen Einfluss auf die Trocknung und Partikelbildung hat und dadurch die Aggregation der gelösten Moleküle an dessen Oberfläche verlangsamt wodurch sich der kritische Zeitpunkt der Krustenbildung signifikant verzögert. Zudem konnte durch geeignete Wahl der Levitationsparameter eine hohe Übereinstimmung zwischen den Simulationsergebnissen und experimentellen Messdaten erzielt werden. Abschließend kann festgehalten werden, dass alle wesentlichen Projektziele erreicht werden konnten und die Kombination aus experimenteller und numerischer Betrachtung der Einzeltropfentrocknung von Proteinlösungen als geeignet angesehen werden kann, die ablaufenden Aggregations- und Inaktivierungsprozesse sowie Strukturveränderungen im Protein besser zu verstehen und in den zeitlichen Ablauf der Trocknung einzuordnen. Die entwickelte Methodik ist damit sehr geeignet zur Untersuchung von derartigen Prozessen und bietet eine hervorragende Grundlage für weiterführende Arbeiten im Bereich der pharmazeutischen Technologie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- “Optical Investigation of the Drying Behaviour of Protein Microdroplets.”, Sensors Day 2017 Cambridge, Großbritannien, 20. Oktober 2017
Perlitz, J.F.A., Koch, H., Prihoda, F., Lee, G., Will, S.
- "Correlation of the kinetics of aggregation and inactivation of L-glutamate dehydrogenase during drying and particle formation of a levitated microdroplet", Drying Technology 37.2 (2018)
Keil, N., Will, S., Lee. G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1080/07373937.2018.1445097) - "Numerical study of droplet evaporation of two-phase flows with heat and mass transfer." Physics of Fluids 30 (2018)
Bänsch, E., Götz, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1063/1.5017936) - “In situ investigation of the protein particle formation process during drying in an acoustic levitator.” PARTEC 2019 International Congress on Particle Technology Nürnberg, Deutschland, 09.-11. April 2019
Perlitz, J.F.A., Koch, H., Prihoda, F., Lee, G., Will, S.
- “Temperature-induced Enzyme Denaturation Characterized by Light Scattering, Intrinsic Fluorescence, SEC and Activity Measurements.”, 3rd European Conference on Pharmaceutics, Bologna, Italien, 25.-27. März 2019
Prihoda, F., Perlitz, J.F.A., Will, S., and Lee, G.
- “Untersuchung der Proteinein-zeltropfentrocknung in einem akustischen Levitator mit Hilfe laseroptischer Messmethoden”, 10. ProcessNet-Jahrestagung und 34. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologien 2020 Aachen, Deutschland, 21.-24. September 2020
Perlitz, J.F.A., Prihoda, F., Bänsch, E., Lee, G., Will, S.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/cite.202055027) - "Measurement of Water Mole Fraction from Acoustically Levitated Pure Water and Protein Water Solution Droplets via Tunable Diode Laser Absorption Spectroscopy (TDLAS) at 1.37 µm", Applied Sciences 11.11 (2021)
Perlitz, J.F.A., Broß, H., Will, S.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/app11115036) - "Measurement of Secondary Structure Changes in Poly-L-lysine and Lysozyme during Acoustically Levitated Single Droplet Drying Experiments by In Situ Raman Spectroscopy." Sensors 22.3 (2022)
Perlitz, J.F.A., Gentner, L., Braeuer, P.A.B., Will, S.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/s22031111) - "Numerical study of single droplet drying in an acoustic levitator before the critical point of time." Chemical Engineering Science 248 (2022)
Doß, M., Bänsch, E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ces.2021.117149) - “Numerical study of single droplet drying in an acoustic levitator,” 14th Annual Meeting, InterPore 2022, Abu Dhabi, United Arab Emirates, 30. Mai - 02. Juni 2022
Doß, M., Ray, N., Bänsch, E.
