Neue Methoden der sequenzspezifischen Modifikation von RNA zum Studium struktureller und funktionaler Aspekte großer Ribozyme

• Antragstellerin: Professorin Dr. Stephanie Kath-Schorr
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 321099169

Die ortsspezifische Markierung von RNA ist insbesondere zur Struktur und Funktionsaufklärung der Vielzahl an langen nicht-kodierenden RNA-Molekülen von essentieller Bedeutung. Synthetisch stellt die sequenzspezifische Markierung von RNA-Molekülen, welche aufgrund ihrer Länge in Gänze nicht mehr festphasensynthetisch hergestellt werden können, immer noch eine Herausforderung dar.Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, neue enzymatische Möglichkeiten der ortsspezifischen Markierung von langen RNA Molekülen zur Untersuchung von Struktur und Dynamik dieser RNAs zu schaffen. Hierzu wird ein semi-synthetischer Ansatz gewählt. Unnatürliche Basenpaare werden als Werkzeug eingesetzt, um enzymatisch über templatgesteuerte in vitro Transkription funktionelle Gruppen für Cycloadditionsreaktionen in RNA einzubringen und die postsynthetische Anknüpfung von Reportergruppen zu ermöglichen. Dieses Prinzip soll zur gezielten Einführung zweier Fluorophore an bestimmten Positionen in transkribierter RNA mittels orthogonaler Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf und kupferkatalysierter Azid-Alkin Cycloaddition eingesetzt werden. Entsprechend modifizierte unnatürliche Nukleosid-Triphosphate sollen den ortsspezifischen Einbau reaktiver Gruppen in längere Oligoribonukleotide unter Standardbedingungen in der in vitro Transkription ermöglichen. Im Rahmen des Projektantrages soll das humane CPEB3 Ribozym auf diese Weise selektiv mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen für FRET-Untersuchungen markiert werden und der Einfluss verschiedener Faktoren auf globale Konformationsänderungen im Ribozym untersucht werden. Vorgeschlagen wird ebenfalls die Erweiterung des Konzeptes zur ortsspezifischen Einführung von Spin-Markierungen in RNA für Abstandsbestimmungen mittels Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie. Die zu entwickelnde Methode stellt eine wertvolle Alternative zu Ligationsansätzen für die Herstellung längerer, sequenzspezifisch modifizierter RNA Moleküle dar und könnte sich als ideales Werkzeug bei der strukturellen Untersuchung funktionaler, nicht kodierender RNA Moleküle einsetzen lassen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen