New methods for sequence-specific modification of RNA to study structural and functional aspects of large ribozymes
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projektes wurde eine neue Methode entwickelt, mit deren Hilfe sequenzspezifisch Methylcyclopropen-modifizierte Nukleotide in funktionelle RNA Moleküle eingebaut werden können. Dies erlaubt die posttranskriptionale Markierung von RNA mit Fluoreszenz-Markern oder Nitroxyl-Spinmarkern über iEDDA Cycloadditionsreaktionen. Zur Markierung von großen, mehrere hundert Nukleotide langen RNA Molekülen für Struktur, Faltungs- und Funktionsstudien wurde ein erweitertes genetisches Alphabet mit nicht natürlichen Nukleotiden eingesetzt, um Cyclopropen-Modifikationen für die kupferfreie Click- Chemie oder Spinmarkierungen ortsspezifisch in RNA einzubauen. Dies erlaubte die enzymatische Synthese langer, an spezifischen Positionen mit Reportergruppen markierter RNA-Oligonukleotide. Es wurden zwei Ribozyme, das B. subtilis glmS Ribozym und das humane CPEB3 Ribozym mit Fluoreszenzmarkern auf diese Weise markiert. Im Fall des CPEB3 Ribozyms wurde eine fluoreszenzbasierte Methode zur co-transkriptionalen Messung der Spaltungsaktivität entwickelt. Hier konnte gezeigt werden, dass so eine deutlich höhere Spaltungsaktivität in vitro gemessen werden kann (die auf höhere Aktivität in vivo schließen lässt), da die korrekte Rückfaltung des Ribozyms in eine katalytisch aktive Struktur nach denaturierenden Aufreinigungsbedingungen normalerweise ineffizient verläuft. Der Ansatz wurde zudem zur ortsspezifischen Markierung von in vitro transkribierter mRNA erfolgreich verwendet. Der orthogonale Einbau beider Komponenten des unnatürlichen Basenpaares in RNA zur Markierung mit zwei Fluorophoren war geplant, wurde allerdings nicht durchgeführt, da sich überraschenderweise zeigte, dass entgegen zu bisher publizierten Daten der Einbau von NaM TP in RNA im Vergleich zu TPT3 TP sehr ineffizient verläuft (Einbaueffizienz unter 25 %). Es wurde daher eine Methode zur Quantifizierung der Einbaueffizienzen beider Triphosphate in RNA über reverse Transkription etabliert und Polymerasen identifiziert, die möglicherweise ein solches Basenpaar in der reversen Transkription tolerieren. In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. O. Schiemann von der Universität Bonn konnten wir erstmals zeigen, dass sich unser Ansatz zur gezielten, posttranskriptionalen Spinmarkierung von RNA für Abstandsmessung mittels EPR-Spektroskopie eignet. Jedoch ist der durch iEDDA Cycloaddition eingeführte Linker zwischen Spinmarker und Nukleobase verhältnismäßig lang und flexibel. Wir entwickelten daher parallel eine Methode zur direkten Spinmarkierung von RNA während der in vitro Transkription und konnten neben Abstandsmessungen in RNA Duplexen auch Abstände im glmS Ribozym über PELDOR messen. Unsere Methode ist somit eine wertvolle Alternative zu Ligationsansätzen für die Assemblierung längerer, modifizierter RNA Moleküle, welche mit geringen Ausbeuten und langwierigen Aufreinigungsschritten verbunden sind und je nach eingeführter Reportergruppe nicht einfach möglich sind (z.B. Spinmarker). Die von uns entwickelte, ortsspezifische enzymatische Markierung von RNA ist insbesondere für die strukturelle Untersuchung einer Vielzahl langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs) hochinteressant, deren Sequenzen durch die enorme Weiterentwicklung von Sequenziertechniken bereits bekannt sind. Zum größten Teil sind deren regulatorische Rollen in der Zelle jedoch völlig unbekannt. Die Sequenzen zwischen unterschiedlichen Spezies sind meist nicht konserviert, höchstwahrscheinlich da die meisten lncRNAs ihre Funktion über ihre dreidimensionale Struktur ausüben. Die Rolle struktureller Elemente in lncRNAs wurde bisher, insbesondere auch aufgrund der Länge dieser RNAs (≥ 200 Nukleotide), nicht untersucht. Der hier entwickelte sequenzspezifische Einbau von Reportergruppen in der in vitro Transkription kann biophysikalische Untersuchungen an solchen lncRNAs erst ermöglichen.
Publications
- "A cyclopropene-modified nucleotide for site-specific RNA labeling using genetic alphabet expansion transcription" Chem. Commun., 2016, 52, 7284-7287
F. Eggert, S. Kath-Schorr
(See online at https://doi.org/10.1039/c6cc02321e) - "Illuminated by foreign letters - strategies for site-specific cyclopropene modification of large functional RNAs via in vitro transcription" Methods, 2017, 120, 17-27
F. Eggert, K. Kulikov, C. Domnick, P. Leifels, S. Kath-Schorr
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.04.021) - "Posttranscriptional spin labeling of RNA by tetrazine-based cycloaddition" Org. Biomol. Chem., 2018
C. Domnick, G. Hageluecken, F. Eggert, O. Schiemann and S. Kath-Schorr
(See online at https://doi.org/10.1039/c8ob02597e)
