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Fluoreszenztechniken zur Kernstrukturdetektion in der Proteinfaltung

Antragsteller Professor Dr. Werner Nau
Fachliche Zuordnung Physikalische Chemie von Molekülen, Flüssigkeiten und Grenzflächen, Biophysikalische Chemie
Biophysik
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Förderung Förderung von 2016 bis 2020
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 321602882
 
Die Aminosäuresequenz eines Proteins bestimmt seine native Struktur, deren biologische Aktivität und auch den Mechanismus der Faltung zu dieser Struktur. Eine Hypothese zur Faltung der Polypeptidkette ist, daß sie mit der Bildung langer Schleifen, Ringe oder Loops startet - stabilisiert durch das Ringschloss (loop node), das heißt, durch zwei kurze Kettensegmente, die miteinander viele Kontakte ausbilden aber entlang der 1D Kette von zwanzig bis hundert Aminosäuren getrennt sind. Diese Hypothese ist an E.coli Adenylatkinase als Modellsystem über Jahrzehnte sowohl mittels herkömmlicher als auch mit zeitaufgelöster Fluoreszenz getestet worden, konkret über Förster-Resonanzenergietransfer-Experimente im Verbund mit stopped-flow und continuous-flow Mischungsexperimenten zur schnellen Einstellung von Entfaltungs- und Rückfaltungsbedingungen. Diese Experimente konnten zeigen, welche Ringe früh gebildet werden und welche Strukturen viel später, aber sie konnten die folgenden Fragen nicht beantworten: 1. Wie groß ist die unabhängige Stabilität eines Rings - die Stabilität, die nur Kontakte zwischen ring-zugehörigen Resten benötigt und keine weiteren Kontakte zu ringfremden Resten? 2. Wie groß ist die Stabilität des Ringschlosses, die nur von Ringschloss-internen Kontakten abhängt und entscheidend für die frühe Ringausbildung ist? 3. Wie können wir die Metastabilität einer Kette im Ringzustand messen, wenn dieser während der frühen Faltung zwar schnell aber nur marginal populiert wird? 4. Was sind die physikochemischen Triebkräfte der Ringschlossbildung? Im Hinblick auf das letztendliche Ziel, der Ableitung der aktiven Struktur der Kette aus ihrer Aminosäuresequenz, sehen wir diese vier Fragen als entscheidend an. Wir möchten die genannten vier Fragen beantworten, indem wir Methoden benutzen, die auf einer einzigartigen spektroskopischen Probe beruhen, auf Diazabicyclo-[2.2.2]-oct-2-en oder DBO, inkorporiert in Polypeptide, wobei die Polypeptide entweder ein einzelnes Ringschloss modellieren oder einen ganzen Ring der Adenylatkinase. DBO, in Kombination mit Tryptophan, Tyrosin oder anderen, geeigneten photophysikalischen Partnern, gewährt uns derzeit Zugang zur FRET-Methode mit der höchsten Distanzauflösung - Kurzdistanz-FRET (sdFRET), die nötig ist, um die Nativähnlichkeit eines Ringschlosses festzustellen. DBO erlaubt zugleich die Verwendung einer Kontaktlöschungsmethode - die kollisionsinduzierte Fluoreszenzlöschung (CIFQ). Diese Methoden und ihre Kombination ermöglichen es uns selbst marginale Populationen metastabiler Ringschlösser zu bestimmen. CIFQ und piezobasierte Drucksprungmessungen gestatten es uns, die Faltungsraten von Ringen zu bestimmen, die entweder bereits in reinem Wasser oder aber nach Zugabe stabilisierender Agentien ausreichend populiert sind. Damit ist die Voraussetzung geschaffen, dem genauen Mechanismus der Ringschlossbildung auf den Grund zu gehen.
DFG-Verfahren Sachbeihilfen
 
 

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