Proteinarchitektur und mechanische Eigenschaften der Clathrin-vermittelten endozytotischen Maschinerie

• Antragsteller: Michal Skruzny, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323495273

Die Clathrin-vermittelte Endozytose ist der hauptsächliche Mechanismus für den Transport von Vesikeln von der Plasmamembran zum Zytoplasma. Sie spielt eine bedeutende Rolle in vielen zellulären Aktivitäten, wo sie für Nährstoffaufnahme, Zellhomöostase und Signaltransduktion benötigt wird. Die Endozytose ist somit ein primärer Anlaufpunkt für die Untersuchung von Membranumbau und Membrantransport, grundlegende Prozesse in allen eukaryotischen Zellen.Während der Endozytose faltet sich die Plasmamembran nach innen und bildet einen endozytotischen Vesikel. Die mechanische Kraft, die für den Umbau der Plasmamembran benötigt wird, kommt aus der schrittweisen Zusammenführung vieler endozytotischer Proteine unterhalb der Membran. Obwohl der zeitliche Rahmen für den Zusammenschluss bekannt ist, ist die Zusammensetzung der endozytotischen Maschinerie noch unklar. Die Kenntnisse in der endozytotischen Proteinarchitektur ist äußerst wichtig für das Verständnis der kraftabhängigen Umbildung der Plasmamembran während der Vesikelbildung.Da sich ~50 Proteinen an einer beugungslimitierten Stelle innerhalb kürzester Zeit zusammenlagern, ist die Analyse der Proteinzusammensetzung an der endozytotischen Stelle eine große Herausforderung. Die Dichte von Proteinen an der endozytotischen Stelle ist besonders gut geeignet um die Proteinorganisation mit Hilfe von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), ein leistungsfähiges Werkzeug für die Detektion von Proteinabständen die kleiner als 10nm, abbilden zu können. Erste Vorversuche für das beschriebene Projekt haben gezeigt, dass FRET auch für die Aufklärung der Organisation des endozytotischen Proteinkomplexes hervorragend geeignet ist.Einer systematische FRET-basierte Suche nach benachbarten Proteinen im endozytotischen Modell der Hefe kann somit helfen die Proteinarchitektur der endozytotischen Maschinerie aufzuklären. Schlüsselproteine des endozytotischen Prozesses werden dazu mit GFP/RFP markiert und ihre relative Nähe in der nativen endozytotischen Stelle bestimmt. Mit Hilfe von proximalen Proteinpaaren soll als nächstes eine potentielle Neuanordung des endozytotischen Proteinkomplexes während der Vesikelbildung untersucht werden. Zum Schluss werden fortschrittliche FRET-Biosensoren eingeführt um die Kraftübertragung der endozytotischen Proteine bei der Membraneinstülpung aufzuklären. Mit diesen Biosensoren kann die Rolle einzelner Proteine für die Membranumbildung, der Einfluss der Plasmamembran oder die Umweltbedingungen die zur Vesikelbildung führen untersucht werden.Die Einführung von hochauflösender in vivo Mikroskopie und Kräfte-Biosensoren erlaubt es ein umfassendes Bild der endozytotischen Maschinerie zu entwickeln und die Schlüsseleigenschaften von mechanischen Prozessen der Vesikelbildung zu beleuchten. Die so gewonnenen Informationen sind für viele Bereiche in der Biomedizin und in den angewandten pharmazeutischen und biotechnologischen Feldern von großem Interesse.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen