Strukturelle Biochemie des Exosoms in der RNA Prozessierung
Final Report Abstract
In dem geförderten Projekt haben wir mit strukturbiologischen, biochemischen, mathematischen und biophysikalischen Methoden die Prozessivitätsfaktoren und biochemischen Eigenschaften des archaealen Exosoms untersucht. Das archaeal Exosom kann als phosphorolytische Nuklease je nach experimenteller Bedingung RNA mit Hilfe von Phosphat prozessiv abbauen oder über NDPs polymerisieren. Das Exosom ist eine selbstkompartimentalisierte Nuklease, d.h. die aktiven Zentren befinden sich im Inneren des Proteins in einer Kammer. Wir konnten in diesem Projekt in zwei methodischen Bereichen große Fortschritte erreichen. Zum einen entwickelten wir eine MCMC basierten Analysemethode, mit deren Hilfe wir zum Ersten mal kinetische Parameter für die komplexe RNA-Abbaukinetik bestimmen und statistisch bewerten konnten. Damit haben wir gezeigt, dass RNA über die Kappen rekrutiert, und durch den Hals sehr prozessiv, aber langsamer abgebaut werden. Werden die RNA Moleküle zu kurz, verlieren sie den Kontakt zu den Kappen, wodurch sie schneller, aber distributiv abgebaut werden. Ein weiterer Durchbruch war die Etablierung eines Einzelmolekülassays zur Analyse des Umschaltens zwischen Abbau- und Polymerisationsaktivität des Exosoms. In den Daten haben wir Hinweise auf einen Gedächtniseffekt gefunden, das für weitergehende Studien interessant sein könnte. Insgesamt ermöglichen diese beiden technologischen Fortschritte nun eine quantitative Analyse der komplexen Biochemie des Exosoms. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Bestimmung der Kristallstruktur eine Ski2-Typ Helikase. Das unbestrittene Glanzlicht war die Struktur des Moleküls im Komplex mit teilweise entwundener DNA, welche weitreichende Einblicke in den Mechanismus von Superfamilie 2 Helikasen mit sich brachte. Insgesamt haben wir für diese Arbeit sehr viel positive Resonanz aus der Gemeinschaft bekommen und die Hel308a Struktur wurde ein Paradigma für Entwindungsmechanismen bei Superfamilie 2 Helikasen.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1021/nl103754z) - Processive RNA decay by the exosome: merits of a quantitative Bayesian sampling approach. RNA Biol. 2011 Jan-Feb;8(1):55-60
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