Die Rolle von Chromatin-assoziiertem Hitzeschockprotein 90 in der Transkriptionsreaktion auf Stress

• Antragsteller: Dr. Ritwick Sawarkar, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 334383909

Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist ein molekulares Chaperon, das einen erfolgreichen Angriffspunkt in der Krebstherapie darstellt. Hsp90 hilft nicht dabei, die vom Ribosom neu-synthetisierten Proteine zu falten, sondern erleichtert die Fertigstellug von teilweise gefalteten Proteinen. Im Menschen existieren zwei Isoformen. Unterschiedliche Phänotypen der Knock-out-Mäuse zeigen jedoch, dass beide Isoformen verschiedene Funktionen besitzen. Anteil von etwa 1-3 Prozent aller Hsp90 Proteine ist im Zellkern lokalisiert. Bei Stress erhöht sich dieser Anteil. Unsere bisherige Arbeit hat gezeigt, daß Hsp90 an Promotoren von 30% aller Drosophila-Gene bindet und bewirkt, dass die RNA-Polymerase II pausiert. Hsp90 bindet und stabilisiert eine Reihe von Chromatin-Modifikatoren und Transkriptionsfaktoren am Chromatin und beeinflusst damit die Genregulation. Allerdings sind die Mechanismen noch nicht ausreichend untersucht. Diese Funktion von Hsp90 in der Genregulation wird noch bedeutender, da Zellen auf Stress mit einer Transkriptionellen Antwort reagieren. Wie regulieren beide Hsp90 Isoformen die Transkription unter Normal- sowie Stressbedingungen? Der vorliegenden Vorschlag versucht diese Frage mit Schwerpunkt auf Chromatin-assoziiertem Hsp90 in menschlichen Zellen zu beantworten.Wir werden alle Versuche in der menschlichen Erythroleukämie-Zelllinie K562 durchführen, eine Tier-1-Zelllinie des ENCODE-Projekt. Als Stress Model verwenden wir Hitzeschock-Behandlung von Zellen, die eine gut untersuchte, robuste und hochkonservierte Antwort auslöst. Das Projekt verwendet K562-Zellen in Normal- sowie Stressbedingungen, mit folgende drei Zielen: (1) Um Chromatin-spezifische Klienten von Hsp90 zu identifizieren, werden wir Tandem-Affinitätsreinigung von getaggten Hsp90 Isoformen durchführen, unter Verwendung von Chromatin Extrakten von K562-Zellen in Normal- sowie in Stressbedingungen. Ein Teil der neuen Interaktionspartner werden auf ihre Stabilität und Lokalisierung am Chromatin geprüft bei gleichzeitiger Inhibierung von Hsp90. (2) Um herauszufinden, an welchen genomische Stellen die beiden Hsp90 Isoformen am Chromatin vor und während Stressbedingungen binden, werden wir Chromatin-Immunopräzipitation mit anschließender Sequenzierung durchzuführen. Wir werden Gene identifizieren, die durch Hsp90 Isoform- und Stress-spezifisch reguliert werden. (3) Integration der genomischen und proteomischen Daten aus den ersten beiden Punkten ermöglicht es die spezifische Rolle der Hsp90-Isoformen in der Stress-induzierten Regulation der Transkriptionsreaktion zu identifizieren. RNA-Sequenzierung von K562-Zellen, unter normalen sowie Stressbedingungen, in denen beide Isoformen ausgeschaltet wurden, wird Aufschluss über die Rolle von Hsp90 in der Transkription bringen. Zusammenfassend wird dieses Projekt die erste umfassende Charakterisierung der Funktionen von Hsp90, einem Chaperon mit immenser biomedizinischen Bedeutung, am Chromatin zur Verfügung stellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen