Quantitative microscopy based on photon statistics (PhotoQuant)

• Applicant: Professor Dr. Hans-Robert Volpp, since 8/2019
• Subject Area: Analytical Chemistry ; Biophysics ; Optics, Quantum Optics and Physics of Atoms, Molecules and Plasmas
• Term: from 2017 to 2021
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 341878689

• Final Report Year: 2021

Final Report Abstract

Mit der Entwicklung der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie ist in den vergangenen Jahren verstärkt Interesse an quantitativen Ansätzen zur Untersuchung zellulärer Prozesse und Strukturen aufgekommen. Zur Bestimmung der Anzahl von Proteinkopien in zellulären Strukturen wurden daher eine Reihe unterschiedlicher Methoden entwickelt. Hierzu gehören Verfahren aus der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, die meist nur eine indirekte Schätzung zulassen und eine Kalibrierung unter gleichen Bedingungen erfordern, oder destruktive Verfahren, wie die Bleichschrittanalyse, mit denen keine zeitaufgelösten Messungen möglich sind. Vor diesem Hintergrund haben wir in den vergangenen Jahren kontinuierlich an der Verbesserung der Einzelphoton-basierten Methode Counting by Photon Statistics (CoPS) gearbeitet, die wir im Rahmen dieses Projekts zu einer relevanten Anwendung in biomedizinischem Kontext gebracht haben. Ausgehend von der Automatisierung des Messprozesses zur Erhöhung der Robustheit und des Durchsatzes haben wir zunächst ein Verfahren entwickelt, mit dem der Markierungsgrad der Fluoreszenzmarkierung von Proteintags bestimmt werden kann. Hiermit kann mit jedem quantitativen Fluoreszenz-basierten Mikroskopieverfahren von der Anzahl der Farbstoffe auf die Anzahl der Proteinkopien extrapoliert werden. In diesem Zusammenhang haben wir außerdem verschiedene Proteinkomplexe hinsichtlich ihrer Eignung als Zählstandard in Zellexperimenten untersucht, sowie verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe hinsichtlich ihrer Eignung für CoPS und anderer quantitativer Fluoreszenzmikroskopieverfahren getestet. Zusätzlich haben wir zu Validierungszwecken ein Bleichschrittanalyse-basiertes Verfahren entwickelt, welches das Zählen von bis zu 35 Farbstoffmolülen zulässt. Aufbauend hierauf haben wir gemeinsam mit Prof. Oliver Fackler (Integrative Virologie, Universitätsklinik Heidelberg) erstmals Proteinkopien des Adaptorproteins SLP76 und deren Phosphorylierung in T-Zellrezeptorclustern bei der Aktivierung von T-Zellen quantitativ untersucht. Hierbei konnten wir die Anzahl der SLP76 Kopien in einzelnen T- Zellrezeptorclustern zu definierten Zeitpunkten nach T-Zellaktivierung, sowie ihren jeweiligen Phosphorzlierungsgrad bestimmen. Vor dem Hintergrund der HIV-Infektion konnten wir auch den Effekt des viralen Proteins NEF auf die Anzahl von SLP76 in T-Zellrezeptorclustern quantifizieren. Mit unseren Arbeiten konnten wir die Anwendung von CoPS zur quantitativen Untersuchung zellulärer Komplexe erfolgreich demonstrieren. Vor dem Hintergrund der aktuellen Entwicklungen im Bereich Einzelphoton-empfindlicher Kameras erscheint die Weiterentwicklung zu einem zeitaufgelösten bildgebenden Verfahren äußerst vielversprechend.

Publications

• Photons in - numbers out: perspectives in quantitative fluorescence microscopy for in situ protein counting, Meth. Appl. Fluoresc. 7 (2019), 12003–012003
  K. S. Gruβmayer, K. Yserentant, D.-P. Herten
  
• An update on molecular counting in fluorescence microscopy, Int. J. Biochem. Cell Biol. 135 (2021), 105978
  J. Hummert, S.A. Tashev, D.-P. Herten
  
• Photobleaching step analysis for robust determination of protein complex stoichiometries, Mol. Biol. Cell (2021)
  J. Hummert, K. Yserentant, T. Fink, J. Euchner, Z.X. Ho, S. Tashev, D.-P. Herten