Systematic and functional genomics of coding and non-coding transcription during gene expression regulation in yeast
Cell Biology
Final Report Abstract
Eukaryotische Genome enthalten funktionelle Elemente - Gene - die direkt die Information für die Synthese eines Biomoleküls, wie z.B. eines Proteins enthalten. Neben diesen kodierenden Genen existiert jedoch eine weitere Informationsebene, die aus Elementen besteht welche die Expression der kodierenden Gene regulieren können. Diese Elemente können DNA Sequenzmotive sein, welche mit Proteinen oder RNA Molekülen interagieren, sie können aber auch selber für RNA Moleküle kodieren die eine Funktion in der Expressionsregulation übernehmen. Diese verschiedenen nicht-proteinkodierenden Elemente sind dabei oft hierarchisch verschachtelt und ihre Sequenzen überlagern sich, so dass es oft sehr schwierig ist die Funktion einzelner Elemente genau zu verstehen. Noch schwieriger ist es, Informationen über die Gesamtheit aller solcher Elemente zu erhalten. In diesem Projekt haben wir verschiedene Methoden entwickelt und angewendet, um systematisch funktionelle Erkenntnisse über die Funktion der nicht-proteinkodierenden Elemente in der Bäckerhefe S. cerevisiae zu erhalten. Die Hefe ist ein Modellsystem welches ein relativ einfach zu manipulierendes Genom besitzt und wir haben zehntausende Stämme hergestellt in denen wir mit verschiedenen Methoden sehr systematisch einzelne nichtproteinkodierende Elemente - jeweils ein anderes in jedem Stamm - manipuliert haben. Dieses systematische Ersetzen von Elementen mit unbekannter Funktion durch bekannte Elemente erlaubt dabei Rückschlüsse über die ursprüngliche Funktion des ersetzten Elements. Durch diese Vorgehensweise haben wir z.B. ein sehr interessantes Element in dem Gen SPS100 gefunden, welches eine nicht-proteinkodierende antisense-RNA exprimiert. Unter bestimmten Wachstumsbedingungen wird diese antisense-RNA von SPS100 kurzzeitig exprimiert, was dazu führt, dass die proteinkodierende RNA des SPS100 Gens stabilisiert und viel höher exprimiert wird als ohne Expression der antisense RNA. Diesen Effekt könnte man als Gedächtniseffekt bezeichnen und er scheint über eine vielzahl von Proteinen, unter anderem von Komponenten des sogenannten Mediator Komplexes reguliert zu werden. In einem weiteren Teilprojekt haben wir einen CRISPR-basierten Ansatz entwickelt um mit Hilfe eines Fusionsproteins aus einer katalytisch inaktiven Cas9 Endonuklease und einer inhibitorischen Proteindomäne die Expression von zehntausenden solcher nicht-proteinkodierenden Genregionen zu unterdrücken und solche zu identifizieren die eine regulatorische Funktion besitzen. In einem ähnlichen, aber technologisch unterschiedlichen Ansatz haben wir auch Reportergene die ein fluoreszierendes Signal geben, an alle Gen-Enden gesetzt, um dadurch den Einfluss der sogenannten 3’ untranslatierten Region (3’UTR), also der Region eines Gens die auf die proteinkodierende Sequenz folgt, zu messen. Für diese Arbeit wurde eine eigene Methode entwickelt, die jedoch separat publiziert wurde, weil sie auch für viele andere Zwecke verwendet werden kann. Durch die Nutzung solcher fluoreszierender Reporter konnten wir mittels Durchflusszytometrie Einzelzellanalysen in insgesamt 24000 Stämmen durchführen. Dies ermöglichte uns auch das sogenannte ‘Gen-Rauschen’ zu messen, also die Präzision, mit welcher ein Gen reguliert wird. Der aus diesen Experimenten hervorgegangene Datensatz wird im Moment noch genauer analysiert, um möglichst viele Faktoren zu identifizieren, die die Präzision der Genexpression beeinflussen. Insgesamt stellt dieses Projekt einen maßgeblichen Schritt in der Hochdurchsatzanalyse nichtproteinkodierender Genomregionen dar. Die dabei entstandenen Datensätze werden auch in Zukunft bedeutende Einblicke in diese Ebene der Genregulation ermöglichen.
Publications
- 2017. Upregulation of SPS100 gene expression by an antisense RNA via a switch of mRNA isoforms with different stabilities. Nucleic Acids Research. 45:11144–11158
Bunina, D., M. Štefl, F. Huber, A. Khmelinskii, M. Meurer, J.D. Barry, I. Kats, D. Kirrmaier, W. Huber, and M. Knop
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gkx737) - 2018. Genome-wide C-SWAT library for high-throughput yeast genome tagging. Nat Methods. 15:598–600
Meurer, M., Y. Duan, E. Sass, I. Kats, K. Herbst, B.C. Buchmuller, V. Dederer, F. Huber, D. Kirrmaier, M. Štefl, K. Van Laer, T.P. Dick, M.K. Lemberg, A. Khmelinskii, E.D. Levy, and M. Knop
(See online at https://doi.org/10.1038/s41592-018-0045-8) - 2018. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3 (Bethesda). 8:79–89
Hennig, B.P., L. Velten, I. Racke, C.S. Tu, M. Thoms, V. Rybin, H. Besir, K. Remans, and L.M. Steinmetz
(See online at https://doi.org/10.1534/g3.117.300257) - 2019. Chromatin-sensitive cryptic promoters putatively drive expression of alternative protein isoforms in yeast. Genome Res. 29:1974–1984
Wei, W., B.P. Hennig, J. Wang, Y. Zhang, I. Piazza, Y.P. Sanchez, C.D. Chabbert, S.H. Adjalley, L.M. Steinmetz, and V. Pelechano
(See online at https://doi.org/10.1101/gr.243378.118) - 2019. YeastRGB: comparing the abundance and localization of yeast proteins across cells and libraries. Nucleic Acids Research. 47:D1245–D1249
Dubreuil, B., E. Sass, Y. Nadav, M. Heidenreich, J.M. Georgeson, U. Weill, Y. Duan, M. Meurer, M. Schuldiner, M. Knop, and E.D. Levy
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gky941) - 2020. Gene dosage screens in yeast reveal core signalling pathways controlling heat adaptation
Jann, C., A. Johansson, J.D. Smith, L. Parts, and L.M. Steinmetz
(See online at https://doi.org/10.1101/2020.08.26.267674) - 2020. TIF-Seq2 disentangles overlapping isoforms in complex human transcriptomes. Nucleic Acids Res. 48:e104–e104
Wang, J., B. Li, S. Marques, L.M. Steinmetz, W. Wei, and V. Pelechano
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gkaa691) - 2021. A functional connection between translation elongation and protein folding at the ribosome exit tunnel in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 49:206–220
Rodríguez-Galán, O., J.J. García-Gómez, I.V. Rosado, W. Wei, A. Méndez-Godoy, B. Pillet, A. Alekseenko, L.M. Steinmetz, V. Pelechano, D. Kressler, and J. de la Cruz
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1200) - 2021. CRISPRi screens reveal genes modulating yeast growth in lignocellulose hydrolysate. Biotechnology for Biofuels. 14:41
Gutmann, F., C. Jann, F. Pereira, A. Johansson, L.M. Steinmetz, and K.R. Patil
(See online at https://doi.org/10.1186/s13068-021-01880-7) - 2021. Rpb4 and Puf3 imprint and post-transcriptionally control the stability of a common set of mRNAs in yeast. RNA Biology. 18:1206–1220
Garrido-Godino, A.I., I. Gupta, F. Gutiérrez-Santiago, A.B. Martínez-Padilla, A. Alekseenko, L.M. Steinmetz, J.E. Pérez-Ortín, V. Pelechano, and F. Navarro
(See online at https://doi.org/10.1080/15476286.2020.1839229)
