Investigation of the pathogenic mechanism underlying the common SPINK1 p.N34S pancreatitis risk haplotype

• Applicant: Professor Dr. Heiko Witt
• Subject Area: Pediatric and Adolescent Medicine ; Gastroenterology
• Term: from 2017 to 2022
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 346764549

• Final Report Year: 2023

Final Report Abstract

Der Trypsininhibitor SPINK1 ist mit Abstand der bedeutendste genetische Risikofaktor für die idiopathische (ICP) wie auch für die sog. tropische chronische Pankreatitis (TCP) und zudem in der Pathogenese der alkoholischen CP von Bedeutung. Etwa 20- 50 % der Patienten mit ICP bzw. TCP tragen eine SPINK1-Mutation, wobei sich bei ca. 80 % dieser Patienten ein Aminosäureaustausch im Codon 34 (p.N34S) findet. Der zugrundeliegende Pathomechanismus dieser Mutation ist seit mehr als 20 Jahren unklar: in vitro-Studien fanden für p.N34S weder erniedrigte Proteinspiegel noch eine verminderte Sekretion, Trypsininhibition oder ein aberrantes Spleißen. PaCa44-Zellen, die heterozygot für p.N34S sind, zeigen allerdings deutlich erniedrigte SPINK1-mRNA- Spiegel für das mutierte Allel im Vergleich zum Wildtyp-Allel, was eine verminderte Genexpression des Risikoallels nahelegt. p.N34S ist Teil eines komplexen Haplotyps bei dem sich 26 nicht kodierende Varianten in starker Kopplung befinden. Mittels bioinformatischer Methoden, public domain- und populationsgenetischer Daten konnten wir die Zahl der möglichen regulatorischen Varianten, die für die gestörte Genexpression verantwortlich sein können, stark einengen. Für den SNP rs148911734 (c.1-7321C>T) zeigte sich in Luziferase-Reportergen-Assays in HEK293-Zellen eine vierfach stärkere Expression des Wildtyp-Allels. Mittels allelspezifischer Affinitäts-Chromatographie/Tandem-Massen-Spektroskopie (AC-MS/MS) konnten wir in Protein-Kernextrakten aus SPINK1-exprimierenden Hepatozyten- und Darm-Zellinien (HepG2 und CaCo2) für rs148911734, aber nicht für zwei weitere untersuchte Kandidaten (rs148276928 und rs142703147), potentielle Bindungspartner identifizieren: GATA4 bzw. GATA6, die stärker am Risikoallel banden und YY1 mit vermehrter Bindung am Wildtyp-Allel. Die allelspezifische Bindung von GATA4/6 und YY1 wurde mittels Supershift-EMSA in CaCo2- und HepG2-Zellen verifiziert. Durch RNA-Seq-Daten aus menschlichen Darmgewebe von p.N34S-Heterozygoten wie auch durch genetische Assoziationsstudien an indischen Probanden konnten wir zusätzliche Evidenz anhäufen, daß rs148911734 der pathogene SNP im p.N34S-Haplotyp ist.

Publications

• Variants That Affect Function of Calcium Channel TRPV6 Are Associated With Early-Onset Chronic Pancreatitis. Gastroenterology, 158(6), 1626-1641.e8.
  Masamune, Atsushi; Kotani, Hiroshi; Sörgel, Franziska Lena; Chen, Jian-Min; Hamada, Shin; Sakaguchi, Reiko; Masson, Emmanuelle; Nakano, Eriko; Kakuta, Yoichi; Niihori, Tetsuya; Funayama, Ryo; Shirota, Matsuyuki; Hirano, Tatsuya; Kawamoto, Tetsuya; Hosokoshi, Atsuki; Kume, Kiyoshi; Unger, Lara; Ewers, Maren; Laumen, Helmut ... & Shimosegawa, Tooru
  
• Loss-of-function variant in chymotrypsin like elastase 3B (CELA3B) is associated with non-alcoholic chronic pancreatitis. Pancreatology, 22(6), 713-718.
  Tóth, Andrea; Demcsák, Alexandra; Zankl, Florence; Oracz, Grzegorz; Unger, Lara Sophie; Bugert, Peter; Laumen, Helmut; Párniczky, Andrea; Hegyi, Péter; Rosendahl, Jonas; Gambin, Tomasz; Płoski, Rafał; Koziel, Dorota; Gluszek, Stanisław; Lindgren, Fredrik; Löhr, J. Matthias; Sahin-Tóth, Miklós; Witt, Heiko; Rygiel, Agnieszka Magdalena ... & Hegyi, Eszter
  
• Variants in the pancreatic CUB and zona pellucida-like domains 1 (CUZD1) gene in early-onset chronic pancreatitis - A possible new susceptibility gene. Pancreatology, 22(5), 564-571.
  Rygiel, Agnieszka Magdalena; Unger, Lara Sophie; Sörgel, Franziska Lena; Masson, Emmanuelle; Matsumoto, Ryotaro; Ewers, Maren; Chen, Jian-Min; Bugert, Peter; Buscail, Louis; Gambin, Tomasz; Oracz, Grzegorz; Winiewska-Szajewska, Maria; Mianowska, Agnieszka; Poznanski, Jarosław; Kosińska, Joanna; Stawinski, Piotr; Płoski, Rafał; Koziel, Dorota; Gluszek, Stanisław ... & Witt, Heiko
  
• Creation of a GATA transcription factor binding site as underlying pathogenic mechanism of the common SPINK1 p.N34S pancreatitis risk haplotype. Pancreatology, 23, e3.
  Unger, Lara; Wallner, Johanna; Eiseler, Katharina; Manisha, Arumalla; von Törne, Christine; Bhaskar, Seema; Sankareswaran, Alagu; Kolmeder, Daniela; Rauscher, Beate; Truninger, Kaspar; Schmidt, Andreas W.; Pilarsky, Christian; Ewers, Maren; Chandak, Giriraj R.; Hauck, Stefanie M.; Laumen, Helmut & Witt, Heiko