Biosynthese des Dolichol-N-Glykan Vorläufers: Analyse dieses Stoffwechselweges mit quantitativer Massenspektometrie

• Antragsteller: Dr. Marcin Luzarowski, seit 12/2023
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289991887

Bei Säugern erfolgt die N-Glykosylierung von Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER). Dabei wird durch den Oligosaccaryltransferase-Komplex (OST) eine komplexe Glykanstruktur von dem lipid-verankerten Dolichol als komplette Einheit auf die N-Glykosylierungsstelle des Zielproteins übertragen. Die Protein-O-Mannosylierung und die Protein-C-Mannosylierung erfolgen ebenfalls im ER, vermittelt durch den Protein-O-Mannosyltransferasekomplex (POMT), bestehend aus POMT1 und POMT2, und durch die C-Mannosyltransferasen. N-Glykosylierung ist eng mit O- und C-Mannosylierung vernetzt, da alle Prozesse zumindest teilweise auf das gleiche Substrat, Dolichol-monophosphat-aktivierte Mannose (Dol-P-Man), angewiesen sind.Für die Synthese des Dolichol-oligosaccharid-Vorläufers, der aus 14 Kohlenhydratresten besteht, ist eine komplexe Kaskade an enzymatischen Schritten erforderlich, an der zwölf ALG Enzyme (asparagine-linked glycosylation) beteiligt sind. Das in Lehrbüchern beschriebene Schema dieses Stoffwechselweges suggeriert einen linearen Ablauf, der wegen der großen Bedeutung dieser posttranslationalen Proteinmodifikation für zelluläre Funktionen gut kontrolliert ist.Die ProteomicsDB ist eine auf massenspektrometrischen Analysen basierende Datenbank humaner Proteine, die normalisierte, absolute Proteinmengen beinhaltet. Diese Daten legen nahe, dass sich die Mengen an ALG Proteinen relativ zueinander um mehrere Zehnerpotenzen in den verschiedenen Geweben und in Zellkulturzellen unterscheiden können. Dies ist erstaunlich für einen hochkonservierten Stoffwechselweg.Ziel diese Projektes ist die Etablierung einer massenspektrometrischen Methode, MRM (multi reaction monitoring), die im Hochdurchsatz eine empfindliche und zuverlässige, quantitative Analyse der zwölf ALK Enzyme erlaubt, die für die Synthese des Dolichol-oligosaccharid-Vorläufers notwendig sind. Teil der Methode werden auch die Mitglieder des OST Komplexes, die Mitglieder des POMT Komplexes und die C-Mannosyltrabsferasen sein. Zur Erfassung der Auswirkungen unterschiedlicher ALK Konzentrationen werden zusätzlich glykosylierte Peptide und deren nicht modifizierte Analoga mit dieser Methode erfasst. Wir wollen klären, ob diese genauere Methode zu ähnlichen Daten führt, wie sie in der ProteomicsDB ermittelt wurden. Außerdem erwarten wir von der Bestimmung absoluter Mengen der einzelnen Enzyme und deren turn-over Raten Informationen zur strukturellen Organisation dieses Stoffwechselwegs. Darüber hinaus wird die Verwendung spezifischer Inhibitoren das Zusammenspiel der verschiedenen Glykosylierungsarten klären.Die Analysen humaner Stammzellen vor und nach Differenzierung sollen zeigen, inwieweit sich die Expression der ALG Enzyme mit der Funktion der Zellen ändern kann. Fibroblasten von Patienten mit Glykosylierungsdefekten werden mit dem Ziel analysiert, Auswirkungen von funktionellem und strukturellem Verlust von ALG1 auf die Expressionswerte der anderen ALG Enzyme festzustellen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2509: Das Zusammenspiel Dolichol-abhängiger Glykosylierungstypen: von Molekülen zu Krankheitsmodellen
• Ehemaliger Antragsteller: Dr. Thomas Ruppert, bis 11/2023