Biochemische und elektrophysiologische Charakterisierung des Aquaporin-Kationenfilters
Final Report Abstract
Aquaporine sind ubiquitär und stellen mit bis zu 200.000 Kopien je Zelle einen großen Anteil der Transportproteine. Je nach molekularem Aufbau der Porenfilterregion sind Aquaporine Wasserselektiv oder erlauben den Durchtritt auch größerer, ungeladener Moleküle wir Glycerol und Harnstoff. Sie sind grundlegend an Prozessen wie der Zellvolumenregulation, der Körperwasserhomöostase, bis hin zum Fettstoffwechsel (Glycerolfreissetzung nach Lipolyse) beteiligt. Trotz extrem hoher Flussraten der Wassermoleküle im Bereich der freien Diffusionsgeschwindigkeit werden Kationen einschließlich Protonen perfekt ausgeschlossen. Die Aufklärung der molekularen Kationenausschluss-Mechanismen ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Aquaporin-Selektivität und deren physiologischer Funktion. Durch das geförderte Projekt konnten wir maßgebliche Beiträge liefern, die sich insbesondere dadurch auszeichnen, dass wir qualitative und quantitative experimentelle Daten gewonnen haben. Bisherige Studien waren rein theoretisch und basierten auf Computersimulationen. Unser Ansatz basierte auf der gezielten Mutation von Aminosäuren in der Porenregion verschiedener Aquaporine und der anschließenden biochemischen Charakterisierung in Bezug auf die Wasser-, Solut- und Ionenleitfähigkeit der resultierenden Mutanten. Da sich das Projekt methodisch an der Schnittstelle zwischen Transport von ungeladenen Molekülen und Ionen bewegte, mussten diverse Techniken aus beiden Gebieten adaptiert werden. Besonders hilfreich für eine rasches Screening der Mutanten war die Etablierung von phänotypischen Assays basierend auf dem Wachstum von Hefe-Kolonien auf Selektionsmedium, das pH- oder Salzstress erzeugte bzw. in dem Kalium limitierend war. Weiterhin wurden mit Hilfe der gewährten stopped-flow Apparatur Assays zur Bestimmung der Wasser- und Soluttransportvermittelten Zellschwellung/-schrumpfung aufgebaut und in Kooperation mit Prof. Thomas Zeuthen, Universität Kopenhagen, elektrophysiologische Messung an Oocyten des Krallenfroschs durchgeführt. Bei der Analyse unserer Mutanten zeigte sich, dass in der Aquaporin-Pore zwei nachgeschaltete Kationenfilter gemeinsam (aromatische Arginin-Region plus NPA-Region) für den vollständigen Kationenausschluss verantwortlich sind. Das Ausschalten nur eines der beiden Filter führte zu minimaler Leitfähigkeit entweder für Protonen (aromatische Arginin-Region) oder für Natrium (NPA-Region). Erst die Elimination beider Filter in Kombination erhöhte die Leitfähigkeit für Protonen als auch Alkali-Kationen massiv. Es ergab sich folgende Permeabilitätssequenz: H+ >> K+ > Rb+ > Na+ > Cs+ > Li+. Die Bedeutung dieser Regionen wurde am humanen Aquaporin-1 und am bakteriellen BccGlpF gezeigt. Zusammengenommen erweitern unsere Ergebnisse entscheidend das Verständnis der Kationenfiltermechanismen von Aquaporinen sowie deren evolutionäre Entstehung.
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