Functional elucidation of YbiB - the defining member of the novel TrpD2 family of prokaryotic nucleoside triphosphatases
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war die detaillierte Funktionsaufklärung der Familie der TrpD2-Proteine am Beispiel des Vertreters aus E. coli, YbiB. In Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass YbiB an DNA und RNA bindet, durch die bakterielle SOS-Antwort auf DNA-Schädigung vermehrt produziert wird, und dass eine Proteinpräparation von YbiB eine 8-oxo-dGTP-spezifische Triphosphatase-Aktivität besaß. Die Relevanz dieser Aktivität liegt in der Beseitigung von oxidativ geschädigtem dGTP aus dem Nukleotid-Pool. Im Förderzeitraum konnte die Triphosphatase-Aktivität in der vorhandenen YbiB-Präparation mehrfach bestätigt werden. Überraschenderweise zeigten neue YbiB-Präparationen diese Aktivität nicht mehr. Die Arbeiten fokussierten sich deshalb darauf, die Reinigungsbedingungen für das Protein so zu optimieren, dass die gesuchte Aktivität wieder vorhanden war bzw. nach aktivierenden Faktoren zu suchen, oder ein anderes, bisher unbekanntes verunreinigendes Protein in der „aktiven“ Präparation zu identifizieren, das für die beobachtete Aktivität verantwortlich war. Mit dem Aufbrauchen der aktiven Präparation mussten Experimente in diese Richtung leider beendet werden. Um die erarbeiteten Methoden effektiv weiter zu nutzen, stiegen wir auf ein neues Projekt mit dem Arbeitstitel „In search for RNA-binding metabolic enzymes in E. coli" um. Die Kernfragestellung dabei ist, ob es auch in E. coli in größerem Umfang Proteine gibt, die neben ihrer eigentlichen Funktion als Enzym in einem Stoffwechselweg als „Nebentätigkeit“ auch RNA binden können und damit andere Prozesse, ggf. auch in anderem funktionellen Zusammenhang, regulieren. Solche bifunktionellen Proteine sind in Bakterien bisher kaum bekannt. Mit der Veröffentlichung von Hochdurchsatz-Screenings nach bakteriellen RNA-bindenden Proteinen im Jahre 2019 war es erstmals möglich, von einer solchen Datengrundlage ausgehend mögliche Kandidaten gezielt zu untersuchen. Wir wählten insgesamt 26 vielversprechende Enzyme aus, stellten sie her und testeten sie mit vier verschiedenen Verfahren auf RNA-Bindung. Dabei konnten wir zwei RNA-bindende Kandidaten identifizieren, von denen einer, das Enzym Quinon-Oxidoreductase (QorA), derzeit abschließend untersucht wird. Eine Veröffentlichung der Ergebnisse ist derzeit in Vorbereitung. Mit unseren Arbeiten haben wir auch die methodischen Grundlagen geschaffen, um in unserer Arbeitsgruppe weitere RNA-bindende Enzyme effizient untersuchen zu können.
