Identifikation von funktionellen Enhancer-Mutationen in der Gehirnentwicklung von Primaten
Evolution, Anthropologie
Evolutionäre Zell- und Entwicklungsbiologie der Tiere
Humangenetik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Projekt “Identifikation von funktionellen Enhancer-Mutationen in der Gehirnentwicklung von Primaten” haben wir 30.707 humanspezifische Basensubstitutionen auf ihre genregulatorische Aktivität getestet. Dazu haben wir in einem MPRA (Massively Parallel Reporter Assay) 137-bp-lange Sequenzfragmente mit jenen 30.707 Substitutionen vor ein Repotergen in einem Plasmid geklont und in humane neuronale Stammzellen transfiziert. Jedes Fragment war in einer menschlichen und einer Schimpansen-Sequenzvariante vorhanden. Etwa 5% (4.181) der untersuchten Sequenzfragmente zeigten dabei genregulatorische Aktivität. Von den aktiven Fragmentpaaren zeigten etwa 13% (876) Aktivitätsunterschiede zwischen der Menschen- und der Schimpansenversion. In den meisten der untersuchten Fragmente befanden sich außer der Substitution im Fokus auch weitere Substitutionen, oder andere Sequenzvarianten, (z.B. nicht humanspezifische). Um die Aktivität jeder einzelnen Substitution gesondert analysieren zu können, haben wir in einem zweiten MPRA alle möglichen Kombinationen jeder Substitution mit jeder anderen im gleichen Fragment sowie mit Hintergrundvarianten hergestellt (insgesamt 14.547 Fragmente). Damit konnten wir 438 individuelle Substitutionen identifizieren, die spezifische genregulatorische Effekte aufwiesen. Die Effekte dieser Substitutionen waren entweder additiv oder interaktiv in Kombination mit anderen Substitutionen oder mit der Hintergrundvariation. Interaktive Substitutionen waren häufiger nah beieinander als additive Substitutionen, was einen Mechanismus nahelegt, bei dem die Bindeaffinität eines Transkriptionsfaktors von zwei Substitutionen gleichzeitig beeinflusst wird. Wir konnten Beispiele finden, in denen ein oder zwei Substitutionen vorhergesagte Bindestellen von Transkriptionsfaktoren verändern. Die individuellen Substitutionen, die wir in diesem Experiment identifizieren konnten, können als Eingangspunkt für weitergehende Experimente dienen. Dieser MPRA diente dazu, eine große Anzahl von Substitutionen zu screenen. Weiterführende Analysen können nun mithilfe komplexerer Modelle für die menschliche Hirnentwicklung weiterreichende Einblicke zu den spezifischen Effekten einzelner Substitutionen liefern.
