Regulation and functions of polyphenol oxidases (PPOs) in the moss Physcomitrella
Final Report Abstract
Polyphenoloxidasen (PPOs) sind Enzyme des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, die Verbräunungsreaktionen nach Gewebeverletzungen verursachen. Fast alle höheren Pflanzen besitzen PPOs, die meist durch eine Genfamilie mit mehreren PPO-Genen kodiert werden. Zahlreiche Untersuchungen wurden in den letzten Jahrzehnten zu PPOs höherer Pflanzen vorgenommen, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PPOs für unterschiedliche Prozesse von Bedeutung sein können, z.B. Pathogen-/Herbivor-Abwehr, Schutz vor Starklichtschäden, Hemmung von Proteolysevorgängen oder Ausbildung der Blütenfarbe. Eine generelle biologische Funktion pflanzlicher PPOs ist nicht bekannt. Während der Projektlaufzeit haben wir PPOs der basalen Landpflanze, dem Moos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. untersucht. Physcomitrella besitzt intra-und extrazellulär PPO-Aktivität und eine große PPO-Genfamilie mit 12 paralogen Genen (PpPPO1 - PpPPO12). Unsere Metagenomanalysen lassen vermuten, dass sich PPOs mit der Besiedelung des Landes entwickelt haben und möglicherweise aus bakteriellen Tyrosinasen hervorgegangen sind. Dass die PPO-Gene aus Physcomitrella auch tatsächlich o-Diphenoloxidase-Aktivität besitzen wurde am Beispiel von PpPPO11 gezeigt: Nach Expression in E. coli und Enzymaktivitätsmessungen zeigte PPO11 o-Diphenoloxidase-Aktivität. Die Analyse der Expression der PPO-Genfamilie mittels real-time-RT-PCR ergab, dass die einzelnen PPO-Gene unterschiedlich stark exprimiert werden, und dass sich dieses Expressionsprofil in Abhängigkeit vom Alter der Kultur sowie von abiotischen Kulturparametern stark verändert. Unter Starklichtbestrahlung (~1000 µmol m-2s-1) war die Expression von PPO4 und PPO12 stark erhöht. Nach Applikation des putativen PPO-Substrates Kaffeesäure wurden die PPO1- und PPO8- Transkription erhöht. Zur Funktionsaufklärung wurden PPO1-knockout-Pflanzen hergestellt, die kein funktionelles PPO1- Protein bilden konnten. Die extrazelluläre Gesamt-PPO-Aktivität dieser Pflanzen war um ca. 60 % geringer im Vergleich zum Wildtyp. Das Expressionslevel der Gene PPO2 - PPO12 in den PPO1- knockout Pflanzen war in hohem Maße unabhängig von PPO1, da sich das Expressionsmuster von PPO2 - PPO1 in den PPO1-knockout-Pflanzen nicht wesentlich im Vergleich zum Wildtyp unterschied. Darüberhinaus wurde eine geringere Toleranz der PPO1-knockout-Pflanzen gegenüber dem in vitro PPO-Substrat 4-Methylcatechol beobachtet: Pflanzen ohne PPO1 zeigten eine geringere Vitalität und starben deutlich früher als der Wildtyp unter Zusatz von 4-Methylcatechol. Die PPO1-knockout-Pflanzen zeigten außerdem ein anormales Protonemawachstum mit kürzeren und rundlicheren Chloronemazellen, und sie produzierten wesentlich mehr Gametophoren als der Wildtyp. Weiterhin wurde das Spektrum putative PPO-Substrate von Physcomitrella analysiert. HPLC- Analysen ergaben, dass Physcomitrella phenolische Substanzen nur in geringen Mengen produziert und diese zum Teil sekretiert. Mittels LC-MS-Analysen konnten fünf Substanzen identifiziert werden, die sowohl intra- als z.T. auch extrazellulär vorkommen: 4-Hydroxybenzoesäure, p-Kumarsäure, Protokatechusäure, Salicylsäure und Kaffeesäure. Die Ergebnisse dieses Projektes deuten darauf hin, dass die verschiedenen PPOs unterschiedliche Funktionen in Physcomitrella besitzen. PPO1 und möglicherweise PPO8 könnten durch die Metabolisierung von inhibierenden phenolischen Substanzen an der Erhaltung geeigneter extrazellulärer Bedingungen beteiligt sein. Für PPO1 wurde gezeigt, dass es Einfluss auf Differenzierungsprozesse nimmt. Andere Physcomitrella PPOs (möglicherweise PPO4 und PPO12) könnten in Starklicht-Reaktionen involviert sein. Aufgrund der phylogenetischen Schlüsselposition von Bryophyten, eröffnen die Charakterisierung der Physcomitrella PPO-Genfamilie sowie weiterführende Untersuchungen der generierten PPO- defizienten Pflanzen neue Möglichkeiten, die Evolution und Funktion von PPOs in Landpflanzen zu untersuchen.
Publications
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(2007): Characterisation of the polyphenol oxidase multigene family from Physcomitrella patens, at the Botanical Congress of the German Botanical Society 2007 in Hamburg, Germany
Hanna Richter, Reinhard Lieberei, and Klaus von Schwartzenberg
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(2008): The polyphenol oxidase multigene family of Physcomitrella, at MOSS 2008 in Tampere, Finland
Hanna Richter, Reinhard Lieberei, Stefan A. Rensing, and Klaus von Schwartzenberg
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(2009): Organisation and transcriptional regulation of the polyphenol oxidase (PPO) multigene family of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. and functional gene knockout of PpPPO1; PhD thesis at the University of Hamburg
Hanna Richter
