Novel Oncogenic Drivers in Multiple Myeloma: Defining the Role of DIS3 Mutations
Final Report Abstract
Durch eine umfassende genomische Analyse von über 200 Patienten hatten wir im Vorfeld dieses Projekts die wichtigsten Treibermutationen im Multiplen Myelom, einer bösartigen Erkrankung des Knochenmarks mit Ursprung in der Plasmazelle, charakterisiert. Während wir wiederkehrende Mutationen in bekannten Onkogenen und Tumorsuppressorgenen identifizieren konnten, fanden wir ebenso wiederkehrende Mutationen in DIS3. Als katalytische Komponente des RNA-Exosoms, welches in der Prozessierung und Degradation verschiedener RNA-Spezies involviert ist, spielt DIS3 eine zentrale Rolle in der Regulation von RNA Abundanz. DIS3-Mutationen treten in 15 bis 20% aller Myelom-Patienten auf und es gibt zahlreiche Hinweise dafür, dass diese eine wichtige Rolle als Treibermutationen spielen und möglicherweise zudem Mediatoren von Therapieresistenz darstellen. Im Rahmen dieses Projektes planten wir daher zu untersuchen, wie DIS3-Mutationen zum Fortschreiten der Erkrankung im Multiplen Myelom beitragen und insbesondere den funktionellen Effekt von DIS3-Mutationen auf Zellproliferation, Zellzyklus und Apoptose zu untersuchen sowie die molekularen Mechanismen zu definieren, wie DIS3-Mutationen als Treibermutationen der Erkrankung wirken. Um den Effekt von spezifischen DIS3-Mutationen in unterschiedlichen Proteindomänen zu untersuchen, nutzten wir die CRISPR/Cas9-Technologie, um Knockouts zu erzeugen sowie spezifische Mutationen in Myelomzelllinien einzufügen und stellten Einzelzellklone her. Jedoch zeigten sich sowohl bezüglich des Phänotyps als auch bezüglich des Zellzyklus keine relevanten Unterschiede zwischen heterozygoten Mutanten und dem Wildtyp. Die Generation von homozygoten Knockouts gelang trotz wiederholter Versuche nicht, woraus wir letztlich schlussfolgerten, dass DIS3 für Myelomzellen essentiell sein muss und ein kompletter Verlust nicht toleriert wird. Auch der Versuch, einen Loss-of-Heterozygosity-Knockout in einer bereits heterozygoten Myelomzelllinie zu erzeugen, scheiterte jedoch, im Gegenteil zeigte sich eine Reversion zum Wildtyp, sodass von einem hohen Selektionsdruck ausgegangen werden muss. Es erfolgte eine Quantifizierung der Allelfrequenzen, welche nach Einzelzellklonierung eine niedrigere Frequenz des mutierten Allels als zuvor ergab. Um den molekularen Effekt von DIS3-Mutation in primären Myelomzellen genauer zu untersuchen, analysierten wir Sequenzierdaten von Myelomzellen von Patienten mit und ohne DIS3-Mutation. Hier zeigte sich, dass Patienten mit DIS3-Mutation signifikant mehr Mutationen aufweisen als Patienten ohne DIS3-Mutation, was darauf hindeutet, dass DIS3-Mutationen mit genetischer Instabilität assoziiert sind. Dieser Effekt erklärt sich am ehesten durch unvollständige R-Loop-Resolution. In einem weiteren Projekt führten wir Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Myelomzellen durch und konnten hier zeigen, dass zelluläre Plastizität neue Therapiemöglichkeiten eröffnet. Wir konnten zeigen, dass differentielle Regulonnutzung und transkriptionelle Umprogrammierung zu veränderten transkriptionellen Zuständen führt, welche mit veränderter Chromatinakzessibilität und Enhancer-Reprogrammierung einhergehen. Die Behandlung der Zellen mit Standardtherapiemethoden förderte weiterhin die transkriptionelle Reprogrammierung, wodurch neue Angriffspunkte für Immuntherapien entstanden, welches genutzt werden kann um Therapieresistenz zu umgehen.
