High performance auxiliaries for a cysteine-tolerant native chemical ligation at arbitrary sites
Final Report Abstract
Die Native Chemical Ligation (NCL) ist ein Grundpfeiler der Proteintotalsynthese. In ihrer ursprünglichen Form ist die NCL jedoch auf Peptidfragmente mit einem N-terminalen Cystein beschränkt, was die Anwendungsbreite begrenzt. Ziel des Vorhabens war es, eine allgemein anwendbare Methode zu entwickeln, welche unabhängig von der Ligationsstelle eine rasche Verknüpfung der Peptidfragmente ermöglicht. Wir setzten auf die Entwicklung neuer Ligationsauxiliare. Diese imitieren die für die NCL benötigte Cysteinstruktur durch Anhängen einer Aminothiol-Hilfsgruppe an den N-Terminus des Peptids. Mit den "Pionier-Auxiliaren" vom ß-Mercapto-alpha-arylethyl-Typ gelingen NCL-Reaktionen nur, wenn ein Glycin an der Ligation beteiligt ist. Ursächlich hierfür ist die sterische Hinderung, die durch einen alpha-ständigen Substituenten am sekundären Amin aufgebaut wird. Wir änderten den Bauplan. Möglich wurde dies durch die Entdeckung einer radikalischen Fragmentierung, die N-amidisch gebundene ß-Mercaptoethylgruppen unter milden Bedingungen entfernt. Der Mechanismus dieser neuen Reaktion wurde detailliert untersucht (Chem. Eur. J. 2018, doi.org/10.1002/chem.201705927). Mit der ß-Mercapto-ß-phenyl-ethyl(MPE)-Gruppe stellten wir das erste Auxiliar vor, das die NCL auch jenseits von Glycin zulässt, was wir auf das Fehlen alpha-ständiger Substituenten zurückführen. Ligationen an ß-verzweigten Aminosäuren wie Valin blieben jedoch schwierig. Im Forschungsvorhaben entwickelten wir "Hochleistungs"-Auxiliare, die hohe Reaktivität in der NCL vermitteln und ohne Nebenreaktionen rasch abgelöst werden können. Zunächst war es das Ziel, ein ß-Seleno-ß−phenylethyl-Auxiliar herzustellen. Unseren Bestrebungen kam Ping Wang zuvor. Seinen Untersuchungen zur Folge reagierte das ß-Seleno-ß−phenylethyl-System an sterisch gehinderten Ligationsstellen jedoch überraschend langsam. Nach vielgestaltigen Variationen der Auxiliarstruktur erkannten wir ein prinzipielles Problem bei auxiliargestützten NCL-Reaktionen an sterisch gehinderten Aminosäuren. Häufig bleibt die Reaktion auf der Stufe des zunächst gebildeten Thioesterintermediats stehen, d.h. die im nachfolgenden S,N-Acyltransferschritt erfolgende Umlagerung zum N-verknüpften Endprodukt findet nicht statt. Als game changer erwies sich der Austausch des Phenylrings im MPE-Auxiliar durch einen Pyridinring im ß-Mercapto-ß-2-pyridyl-ethyl(MPyE)-Auxiliar (publiziert in Angew. Chem. Int. Ed. 2021, doi.org/10.1002/anie.202107158). Wir entdeckten, dass der Pyridinring einen kritischen Protonentransferschritt durch Basenkatalyse beschleunigen kann. Als erstes seiner Art ermöglicht das MPyE-Auxiliar die NCL an ß-verzweigten Aminosäuren. Durch Rückgriff auf Selenosterligationen reagieren sogar Peptidylproline. Eine solche Anwendungsbreite blieb den bisher bekannten Ligationsauxiliaren verwehrt. Die Synthese eines de novo designten 99mer Peptids und eines 80 Aminosäuren langen MUC1-Peptids veranschaulichten den Nutzen des MPyE-Auxiliars. Im weiteren Verlauf der Förderperiode untersuchten wir die Rolle des Ringstickstoffs. Hierzu änderten wir die Position und führten Substituenten ein. Ein 4-Pyridinsystem zeigte keine Reaktionsbeschleunigung. Substituenten, die die Basizität des Ringstickstoffs mindern, verringern die Geschwindigkeit der NCL. Erhöhung der Basizität erhöht die Reaktivität. All dies erhärtet das neue Paradigma, nach dem die auxiliargestützte NCL durch intramolekulare Basenkatalyse beschleunigt werden kann. Im Zuge der Arbeiten wurden wir auf Nebenreaktionen aufmerksam, die einen vorzeitigen Verlust des Auxiliars bewirken. Diese Nebenreaktion findet unter mild sauren Bedingungen statt und kann die Ausbeuten von NCL-Reaktionen an schwierigen Ligationsstellen mindern. Mit der ß-Mercapto-ß-(4-methoxy-2-pyridinyl)-ethyl (MMPyE)-Gruppe entdeckten wir ein Auxiliar, das bei erhöhter Stabilität immer noch Reaktionen an ß-verzweigten Aminosäuren ermöglicht und nach wie vor unter mild basischen Bedingungen (pH8.5) spaltbar ist. Die Synthese eines 120 aa langen Peptids, das acht MUC5AC-Tandemwiederholungen enthält, illustriert die Nützlichkeit des Auxiliars. Die Nutzung der bisher unerforschten Auxiliar-gestützten NCL zu Tyrosin eröffnete den Zugang zu einem Kopf-zu-Schwanz-zyklisierten 21-mer Peptid und einem His6-markierten hexaphosphorylierten Peptid, das 6 Heptapeptidwiederholungen der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II aufspannt. Die Herausforderungen bei der Synthese multiphosphorylierter Proteine haben wir kürzlich zusammengefasst (Chem. Soc. Rev. 2022, doi.org/10.1039/D1CS00991E). In weiteren Arbeiten war geplant, die neuen Ligationsauxiliare in der Synthese von phosphorylierten SH3-Domänen einzusetzen. Die Synthese der NEDD9-SH3-Domäne durch Gln-Asn-Ligation zwischen einem 33mer und einem 30mer gelang. Jedoch mussten wir feststellen, dass Aggregation des [36- 65]NEDD9-SH3-Fragments das upscaling behindert. Auf eine ähnliche Problematik trafen wir bei der p130Cas-SH3-Domäne. Die Arbeiten zeigen, dass unabhängig von Ligationsauxiliaren weitere Entwicklungen von Nöten sind, um die NCL von „difficult peptides“ zu ermöglichen (J. Pep. Sci 2019, doi.org/10.1002/psc.3198) und Chem. Soc. Rev. 2022, doi.org/10.1039/D1CS00991E). Dies soll Gegenstand künftiger Arbeiten sein.
Publications
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"Features of Auxiliaries that Enable Native Chemical Ligation beyond Glycine and Cleavage via Radical Fragmentation". Chem. Eur. J. 2018, 24, 3623-3633
S. F. Loibl. A. Dallmann, K. Hennig, C. Juds, O. Seitz
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"Templated Chemistry for Bioorganic Synthesis and Chemical Biology (Max Bergmann Award Lecture)". J. Pep. Sci. 2019, 25, 23198
O. Seitz
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“Enabling cysteine-free native chemical ligation at challenging junctions with a ligation auxiliary capable of base catalysis“. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 19483-19490; Angew. Chem. 2021, 133, 19633-19640
O. Fuchs, S. Trunschke, H. Hanebrink, M. Reimann, O. Seitz
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“Dissecting the role of protein phosphorylation: a chemical biology toolbox”. Chem. Soc. Rev. 2022, 51, 5691-5730
O. Seitz
