Untersuchung der Entstehung revertanter Muskelfasern mit Hilfe einer neuen muskeldystrophischen Reportermaus (DmdEGFP-mdx)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine tödlich verlaufende neuromuskuläre Erbkrankheit und wird durch Mutationen verursacht, die das offene Leseraster des DMD-Gens stören und die Expression des Dystrophin-Proteins verhindern. Dennoch findet man wenige Dystrophin-positive Fasern, sogenannte "revertante Fasern" (RFs), allein oder in Gruppen in einem ansonsten Dystrophin-negativen Muskel. Dieses Phänomen tritt sowohl bei Patienten als auch im mdx-Mausmodell der Krankheit auf. RFs exprimieren eine intern deletierte, verkürzte Form des Dystrophin-Proteins, von dem man annimmt, dass es die Funktion der Muskelzellen schützt. Das revertierende Ereignis ist jedoch viel zu selten, um von klinischer Bedeutung zu sein. Forscher haben postuliert, dass sekundäre Ereignisse (z.B. somatische Mutationen) aufgetreten sein müssen, die zur Wiederherstellung des Leserasters geführt haben. Ziel unserer Studie war es, den molekularen und zellbiologischen Ursprung und die Entwicklung von spontan auftretenden revertanten Fasern zu verstehen, in denen die Expression des Dystrophins trotz einer Dmd-Keimbahnmutation (Stop-Mutation) wiederhergestellt wird. Wir sind dieser Frage nachgegangen, indem wir ein transgenes Dystrophin-Reportermausmodell für die Krankheit entwickelt haben: die DmdEGFP-mdx-Maus. Mit diesem Modell hatten wir zum ersten Mal die technische Möglichkeit, RFs in vivo ohne Immunfärbung direkt sichtbar zu machen und nachzuweisen. Außerdem konnten wir intakte RFs zusammen mit ihren anhaftenden Satellitenzellen isolieren, indem wir visuell solche Fasern identifizierten, die das EGFP-Dystrophin-Fusionsprotein exprimierten. Wir konnten so ohne Antikörper-Färbung nachweisen, dass die Expression des revertierten Dystrophins im Skelett- und Herzmuskel an der richtigen subzellulären Position stattfand. Intravitalmikroskopie an anästhesierten Mäusen ermöglichte es uns, das sarkolemmale Dystrophin-EGFP-Fusionsprotein der revertierten Fasern live zu beobachten. Wir isolierten einzelne revertante Fasern mit ihren angehängten Satellitenzellen und kultivierten sie. Die Dystrophin-EGFP-Fluoreszenz blieb ex vivo erhalten und ermöglichte es, das revertierte Dystrophin in isolierten Fasern ex vivo zu beobachten. Wir haben erfolgreich mRNA aus einzelnen revertanten Fasern extrahiert und die RNA-Sequenzierung einzelner Fasern durchgeführt. Zum ersten Mal konnten wir zeigen, dass jede RF ein unterschiedliches, kürzeres in-frame gespleißtes RNA-Transkript exprimiert und damit ein spezifisches Exon-skipping-Muster zeigt, welches sich zwischen verschiedenen, nicht benachbarten RFs unterscheidet. Wir waren in der Lage, Muskelstammzellen aus revertierten Fasern zu kultivieren, konnten jedoch keine klonalen Kulturen etablieren und daher nicht nachweisen, ob das revertierende Ereignis seinen Ursprung in einzelnen Muskelstammzellen hat und somit den genauen molekularen Mechanismus der zur Entstehung von RFs führte, leider nicht aufklären. Nichtsdestotrotz haben wir das erste geeignete Modell geschaffen, um revertante Fasern in vivo und ex vivo zu untersuchen, und wir haben die Grundlage und das Tiermodell für weitere Experimente zur Aufklärung des RF-Phänomens entwickelt. Das Verständnis der RF-Biologie wird zu einem besseren Verständnis der molekularen Pathogenese der DMD führen und könnte zur Entwicklung neuer Therapien beitragen, die den körpereigenen Mechanismus der Patienten zur Wiederherstellung der Dystrophin- Expression nutzen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Live‐imaging of revertant and therapeutically restored dystrophin in the DmdEGFP‐mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology, 46(6), 602-614.
Petkova, M. V.; Stantzou, A.; Morin, A.; Petrova, O.; Morales‐Gonzalez, S.; Seifert, F.; Bellec‐Dyevre, J.; Manoliu, T.; Goyenvalle, A.; Garcia, L.; Richard, I.; Laplace‐Builhé, C.; Schuelke, M. & Amthor, H.
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Dystrophin myonuclear domain restoration governs treatment efficacy in dystrophic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(2).
Morin, Adrien; Stantzou, Amalia; Petrova, Olga N.; Hildyard, John; Tensorer, Thomas; Matouk, Meriem; Petkova, Mina V.; Richard, Isabelle; Manoliu, Tudor; Goyenvalle, Aurélie; Falcone, Sestina; Schuelke, Markus; Laplace-Builhé, Corinne; Piercy, Richard J.; Garcia, Luis & Amthor, Helge
