Establishment of the premises for using the pro-form of bone morphogenetic protein (BMP-2) as a therapeutic tool
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Antragstellerin besitzt Patentrechte (erteilt für Deutschland, Frankreich, United Kingdom, Schweiz, USA und China) für die Nutzung der Pro-Form des Knochenwachstumsfaktors, Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2). Im Rahmen des DFG-Projektes sollten die Grundlagen für die klinische Nutzung von proBMP-2 erarbeitet werden. Bedingt durch das Anliegen bestand das Arbeitsprogramm aus mehreren nicht-aufeinander aufbauenden Teil Projekten. Folgende Ergebnisse wurden mit den einzelnen Arbeitsblöcken erzielt: 1. Da zum Zeitpunkt der Antragstellung nur proBMP-2 mit einem N-terminalen Histidin-tag zur Verfügung stand und die Expression authentischer cDNA ohne tag in E. coli nicht möglich war, wurde zuerst durch wobble-Mutagenese in der dritten Codonposition ein DNA-Konstrukt erhalten, welches in E. coli-Zellen exprimiert werden konnte. Dadurch kann nun authentisches proBMP-2 rekombinant hergestellt werden. 2. Es wurde ein Rückfaltungsprotokoll für reifes BMP-2 entwickelt, das auch auf proBMP-2 angewendet werden kann und zu besseren Ausbeuten und reduzierten Renaturierungszeiten führt. Durch Anwendung des Protokolls können Produktionskosten verringert werden. 3. Von der kooperierenden Arbeitsgruppe von Prof Dr. Mäder wurde eine neue Formulierung von BMP-2 entwickelt, die eine gute Verträglichkeit bei der Maus zeigte und zur ektopen Knochenbildung führte. Es wurde nicht getestet, ob diese Formulierung auch für proBMP-2 anwendbar ist. 4. Mit reifem BMP-2 als Kontrolle und proBMP-2 wurden im Zellkulturmodell Freisetzungsuntersuchungen durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass BMP-2 sehr viel effizienter als proBMP-2 freigesetzt wird. Möglicherweise ist dies auf das erheblich höhere Molekulargewicht von proBMP-2 mit ca. 95 kDa / Dimer gegenüber BMP-2 mit ca. 25 kDa / Dimer zurückzuführen. 5. Zelluläre Antworten auf BMP-2 und proBMP-2 wurden im Zellkulturmodell untersucht. proBMP-2 führte wie reifes BMP-2 zur Induktion von Knochenmarker-Proteinen. Allerdings waren die durch proBMP-2 hervorgerufenen Induktionsniveaus stets geringer als die durch BMP-2 induzierten Expressionsspiegel. Außerdem traten Antworten auf proBMP-2 verspätet auf. proBMP-2 wird in die Zellen aufgenommen und intrazellulär zu einem Produkt prozessiert, das sehr wahrscheinlich reifes BMP-2 darstellt. Da sich die Konzentration dieses Proteolyseproduktes im Zellkulturüberstand mit der Zeit erhöhte, wird angenommen, dass reifes BMP-2 als Proteolyseprodukt von proBMP-2 sezerniert wird. Durch die Aufnahme in die Zellen, die intrazelluläre Prozessierung und anschließende Ausscheidung von reifem BMP-2 könnte die verzögerte und reduzierte Induktion von Knochenmarker-Proteinen durch die Pro-Form erklärt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010). A novel Two-Step renaturation procedure for efficient production of recombinant BMP-2. Protein Expression and Purification, 73, 65- 69
von Einem, S., Schwarz, E. and Rudolph, R.
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(2010). The influence of covalently linked and free polyethylene glycol on the structural and release properties of rhBMP-2 loaded microspheres. J. Control. Release, 147, 92-100
Lochmann, A., Nitzsche, H., von Einem, S., Schwarz, E. and Mäder, K.
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(2011). The pro-form of BMP-2 exhibits a delayed and reduced activity when compared to mature BMP-2. Growth Factors, epub March 10, 2011
von Einem, S., Erier, S., Bigl, K., Frerich, B. and Schwarz, E.
